Síntesis de un tamoxifeno fotoenjaulado para la activación dependiente de la luz de la modificación genética impulsada por la recombinasa Cre-ER.

La capacidad de marcar células de forma permanente y rastrear su desarrollo, lo que se denomina rastreo de linaje, ha revolucionado la biología del desarrollo. Una sustancia química conocida como Cre puede causar cambios en los genes (es decir, recombinación genética) en una célula de modo que la célula comience a producir proteínas que puedan distinguirse bajo un microscopio o mediante un dispositivo de clasificación de células. Por ejemplo, Cre puede activar un gen que hace que una célula y todos sus descendientes (es decir, las células que produce por división celular) expresen, por ejemplo, una proteína fluorescente verde o roja. El etiquetado de células con estas proteínas coloreadas también puede hacerse específico para un tipo de tejido. Esto se hace colocando la enzima Cre que activa un color junto a un gen que se activa sólo en ciertos tejidos. Por ejemplo, al restringir la expresión de Cre a los vasos sanguíneos, los investigadores descubrieron que el reportero también marcaba las células de la sangre, lo que sugiere que los vasos sanguíneos pueden producir células sanguíneas. Además, Cre se puede fusionar con un receptor de estrógeno (ER), de modo que el etiquetado de color de las células sólo se activa cuando el ER está unido, por ejemplo, por estrógeno o moléculas similares a los estrógenos, como el tamoxifeno o el hidroxitamoxifeno. La exposición de las células al hidroxitamoxifeno permitirá el marcado Cre-ER de las células solo durante el período de tiempo en que el hidroxitamoxifeno esté activo (aproximadamente un día), creando así una única onda de marcado celular. Esto proporciona un nivel adicional de control temporal del marcado celular. Por lo tanto, los investigadores que utilizaron el mismo controlador de vasos sanguíneos para la expresión de Cre-ER demostraron que el marcado de las células sanguíneas se producía sólo cuando se administraba tamoxifeno en las primeras etapas del desarrollo embrionario, lo que indica que sólo los vasos sanguíneos embrionarios pueden producir células sanguíneas. A pesar de la creación de sistemas de marcado celular mediados por Cre y Cre-ER, no pueden restringir el marcado a ubicaciones específicas, como el lado derecho de un órgano o la superficie de un tejido. En este estudio, abordamos este problema sintetizando una molécula de tamoxifeno "fotoenjaulada". El “fotoenjaulamiento” inactiva el tamoxifeno, a menos que sea “liberado” por la longitud de onda de luz apropiada, en este caso, la luz ultravioleta. Validamos el tamoxifeno fotoenjaulado utilizando una línea celular Cre-ER que inicialmente expresa una proteína fluorescente roja, pero cuando Cre está activo cambiará permanentemente a una proteína fluorescente verde. Descubrimos que una exposición de un minuto a los rayos UV era suficiente para liberar el tamoxifeno e inducir el cambio rojo/verde, y una exposición a los rayos UV de 5 minutos podía inducir un nivel casi máximo de liberación de los rayos UV. Una caracterización adicional reveló que la forma enjaulada de tamoxifeno podría ingresar rápidamente a las células y salir de la jaula más tarde, allanando el camino para futuros estudios mediante los cuales se podría inyectar tamoxifeno enjaulado en un animal y exponer una región específica del animal a luz ultravioleta para activar el marcado celular. sólo en esa región. Nuestro trabajo agrega control espacial de la expresión del informador al control temporal y específico de tejido disponible actualmente.