TERAPIA CON CÉLULAS MADRE BASADA EN NUCLEASAS DE DEDOS DE ZINC PARA EL SIDA

Durante el primer año del proyecto, hemos logrado avances significativos en el cumplimiento del primer hito del proyecto: Definir el proceso final de modificación genética de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) (Ítem #14, Hito M3 del diagrama de Gantt). Además, se ha iniciado el esfuerzo inicial en la Fase II de ampliación/pruebas preclínicas (G15) y, más específicamente, en el desarrollo del procesamiento de células madre/progenitoras hematopoyéticas (G16).

Hace unos 10 años se descubrió que los pacientes homocigotos para una mutación natural (la mutación delta 32) en el gen CCR5 son generalmente resistentes a la infección por VIH al bloquear la entrada del virus a una célula. Sobre la base de esta observación, un estudio publicado en 2009 informó sobre una posible "cura" en un paciente con SIDA y leucemia después de recibir un trasplante de médula ósea de un donante con esta mutación delta 32 CCR5. Este enfoque transfirió las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) que residen en la médula ósea del donante delta 32 y proporcionó una fuente autorenovable y de por vida de células inmunes resistentes al VIH. Después del trasplante, este paciente pudo suspender todo el tratamiento farmacológico contra el VIH, el recuento de CD4 aumentó y la carga viral cayó a niveles indetectables, lo que demuestra un trasplante eficaz de protección contra el VIH y sugiere que este enfoque podría tener una amplia utilidad clínica. Pero los donantes con la mutación delta 32 CCR5 generalmente no están disponibles, entonces, ¿cómo podríamos diseñar un estado negativo de CCR5 análogo en HSC humanas para usarlo en trasplantes de médula ósea, incluido el HSPC del propio paciente? Una posible respuesta proviene de las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), que se ha demostrado que bloquean eficazmente la actividad de un gen escindiendo el genoma humano en un sitio predeterminado y alterando la secuencia genética mediante un proceso de reparación del ADN propenso a errores. Esta modificación del ADN celular es permanente y puede bloquear completamente la función genética. Recientemente, se ha demostrado que las ZFN inactivan CCR5 en células T CD4 humanas primarias, lo que les permite sobrevivir y expandirse preferentemente en presencia del VIH. Se está llevando a cabo un ensayo clínico en humanos que evalúa este enfoque, en el que las células T del paciente se reinfunden después del tratamiento con ZFN para bloquear la expresión de CCR5 y posiblemente proporcionar un reservorio de células T CD4 resistentes al VIH. Este equipo de enfermedades del CIRM propuso un enfoque para modificar el HSPC del propio paciente para evitar la necesidad de encontrar donantes compatibles que porten la mutación delta 32 CCR5 y, sin embargo, proporcionen una fuente renovable y duradera de células resistentes al VIH. Se propone probar este concepto en pacientes seleccionados con linfoma de SIDA que se someten habitualmente a un trasplante de HSPC. Durante el segundo año de este proyecto, el equipo de enfermedades logró avances considerables y cumplió con todos los hitos del proyecto para el año 2. Más específicamente, el equipo desarrolló un procedimiento optimizado para introducir de manera eficiente las ZFN específicas de CCR5 en HSPC. Demostramos que estas células modificadas funcionan normalmente y conservan su "tronco" en los sistemas de cultivo de tejidos. También demostramos que estas células modificadas se pueden trasplantar a ratones para reconstituir el sistema inmunológico. Dado que las HSPC son células madre de larga duración, hemos podido detectar estas células de forma estable en ratones durante más de 3 meses después del trasplante. El equipo está en el proceso de ampliar los procedimientos de producción de células para garantizar que podamos generar HSPC modificada con CCR5 a escala clínica. También estamos avanzando con los estudios preclínicos de seguridad y eficacia restantes necesarios antes de iniciar un ensayo clínico.

Es bien sabido que la infección por VIH-1 requiere una proteína llamada CCR5, y las personas con una mutación natural en este gen (CCR532) están protegidas contra el VIH/SIDA. Todo el mundo tiene dos copias del gen CCR5, una heredada de su madre y otra de su padre. Las personas con ambas copias de CCR5 mutadas (CCR532/CCR532) son muy resistentes a infectarse con VIH-1. Si sólo una copia es anormal (CCR5/CCR532), puede ocurrir infección pero la progresión de la infección a SIDA se retrasa. La única cura clara de la infección por VIH-1 se produjo en un paciente con leucemia que recibió un trasplante de células madre sanguíneas de un donante con tejido compatible cuyas células portaban la doble mutación CCR532/CCR532. Después del trasplante, este paciente pudo suspender todos los medicamentos contra el VIH, el sistema inmunológico mejoró y el nivel de VIH-1 en la sangre disminuyó a niveles indetectables. Incluso después de más de 4 años sin tomar medicamentos contra el VIH, se considera que el paciente está curado, ya que no hay evidencia de una infección activa por VIH-1. Este equipo de enfermedades propone tratar células madre sanguíneas de una persona infectada por VIH-1 con una proteína que puede mutar el gen CCR5 y luego trasplantar estas mismas células nuevamente al paciente para intentar reproducir los efectos de la mutación CCR532 proporcionando una fuente renovable y duradera de células resistentes al VIH-1. Esto evitará la necesidad de encontrar un donante de células madre que sea portador de la mutación CCR532/CCR532 y sea una "pareja perfecta" adecuada para el trasplante de tejido. Las proteínas que se utilizarán en este tratamiento se denominan nucleasas con dedos de zinc (ZFN). Los resultados preliminares en ratones trasplantados con células madre sanguíneas tratadas con ZFN han demostrado que las células modificadas son funcionales y producen células de progenie mutantes CCR5, incluidas las células T CD4 que son el objetivo natural del VIH-1. Es importante destacar que, después de la infección por VIH-1, los ratones demostraron cargas virales reducidas, mantenimiento de células T CD4 en tejidos periféricos y una poderosa ventaja de supervivencia para las células CCR5 negativas [Holt et al., Nature Biotechnology 2010; 28: 839-47]. Estos datos respaldan el desarrollo de este enfoque ZFN para tratar a pacientes infectados por VIH-1 aislando primero las células madre sanguíneas del propio sujeto, modificándolas utilizando ZFN específicas de CCR5 y luego reinfundiéndolas nuevamente en el paciente para reconstituir así el sistema inmunológico. con células mutantes CCR5 resistentes al VIH-1. El equipo de enfermedades reunido para lograr este objetivo tiene experiencia en tecnología de células madre [City of Hope], infección por VIH-1 en modelos preclínicos de ratón [Universidad del Sur de California] y en el desarrollo de ensayos clínicos basados ​​en ZFN [Sangamo BioSciences]. En los primeros dos años de estudio, el equipo de enfermedades se centró en el uso de una tecnología de administración existente para introducir ZFN en células madre sanguíneas. Este enfoque utilizó un tipo de vector de terapia génica llamado vector adenoviral, que se había utilizado previamente en ensayos clínicos de investigación en etapa inicial para la modificación de las células T de los pacientes. Durante esta fase del proyecto, el Equipo de Enfermedades pudo establecer un método que permitió la fabricación a gran escala de células madre sanguíneas modificadas con ZFN en condiciones adecuadas para un ensayo clínico. Estos resultados fueron publicados recientemente [Li L. Figura XNUMX Terapia Molecular; publicación anticipada en línea del 16 de abril de 2013]. En el tercer año del estudio, el equipo de enfermedades desarrolló un nuevo método para administrar ZFN a las células madre sanguíneas utilizando ARN mensajero (ARNm o SB-3mR). Utilizando un proceso llamado electroporación, en una técnica que implica exponer una mezcla de células madre sanguíneas y el SB-728mR a un campo eléctrico transitorio, se logró una mutación eficiente del gen CCR5. Estas células pudieron trasplantarse a ratones, donde se injertaron y diferenciaron para generar células inmunes humanas que portaban genes CCR5 mutados. Este enfoque basado en ARNm ha demostrado ser sólido, bien tolerado y elimina todos los componentes del vector viral del proceso de fabricación. Por lo tanto, ahora se ha elegido la electroporación de SB-728mR para pasar a la fabricación a escala clínica y respaldar nuestro ensayo clínico propuesto. En el cuarto año del estudio, el Equipo de Enfermedades completará los estudios necesarios para demostrar la seguridad de estas células madre sanguíneas modificadas y presentará los documentos regulatorios federales y locales requeridos para respaldar el ensayo clínico de Fase I de este nuevo medicamento.

La infección por VIH-1 requiere la entrada del virus a las células uniéndose a una proteína receptora llamada CCR5. Las personas con una mutación natural en el gen que codifica CCR5 (CCR532) están protegidas de la infección por VIH-1 y del SIDA. Todo el mundo tiene dos copias de este gen, una heredada de su madre y otra de su padre. Las personas con ambas copias de CCR5 mutadas (CCR532/CCR532) son muy resistentes a infectarse con VIH-1. Si sólo una copia es anormal (CCR5/CCR532), puede ocurrir infección por VIH, pero la progresión de la infección a SIDA se retrasa. La única cura clara de la infección por VIH-1 se produjo en un paciente con leucemia que recibió un trasplante de células madre sanguíneas de un donante con tejido compatible cuyas células portaban la doble mutación CCR532/CCR532. Después del trasplante, este paciente pudo suspender todos los medicamentos contra el VIH, el sistema inmunológico mejoró y el nivel de VIH-1 en la sangre disminuyó a niveles indetectables. Incluso después de más de 6 años sin tomar medicamentos contra el VIH, se considera que el paciente está curado, ya que no hay evidencia de una infección activa por VIH-1. Este equipo de enfermedades propuso tratar las células madre sanguíneas de una persona infectada por VIH-1 con una proteína que puede mutar el gen CCR5 y luego trasplantar estas mismas células nuevamente al paciente. La idea era intentar reproducir los efectos de la mutación CCR532 proporcionando una fuente renovable y duradera de estas células resistentes al VIH-1. Este enfoque evita la necesidad de encontrar un donante de células madre que sea portador de la doble mutación CCR532/CCR532 y sea una "pareja perfecta" adecuada para el trasplante de tejido. Las proteínas que se utilizarán en este tratamiento se denominan nucleasas con dedos de zinc (ZFN). Los resultados preliminares en ratones trasplantados con células madre sanguíneas tratadas con ZFN mostraron que las células modificadas son funcionales y producen células de progenie mutantes CCR5, incluidas las células T CD4 que son el objetivo natural del VIH-1. Es importante destacar que, después de la infección por VIH-1, los ratones demostraron cargas virales reducidas, mantenimiento de células T CD4 en tejidos periféricos y una poderosa ventaja de supervivencia para las células CCR5 negativas [Holt et al., Nature Biotechnology 2010; 28: 839-47]. Estos datos respaldaron el desarrollo de este enfoque ZFN para tratar a pacientes infectados por VIH-1 aislando primero las células madre sanguíneas del propio sujeto, modificándolas utilizando ZFN específicas de CCR5 y luego reinfundiéndolas nuevamente en el paciente para reconstituir así el sistema inmunológico. con células mutantes CCR5 resistentes al VIH-1. El equipo de enfermedades reunido para lograr este objetivo tiene experiencia en tecnología de células madre [City of Hope], infección por VIH-1 en modelos preclínicos de ratón [Universidad del Sur de California] y en el desarrollo de ensayos clínicos basados ​​en ZFN [Sangamo BioSciences]. El equipo de enfermedades desarrolló un nuevo método para administrar ZFN a las células madre sanguíneas utilizando ARN mensajero (ARNm o SB-728mR). Utilizando un proceso llamado electroporación, una técnica que implica exponer una mezcla de células madre sanguíneas y el SB-728mR a un campo eléctrico transitorio, se logró una mutación eficiente del gen CCR5. Este método fue probado en ratones y nuevamente mostró evidencia de protección contra el VIH-1. Luego, la electroporación de SB-728mR se trasladó a la fabricación a escala clínica para respaldar el ensayo clínico propuesto. En el año 4 del estudio, el Equipo de Enfermedades completó estudios que demostraban la seguridad de estas células madre sanguíneas modificadas y obtuvo las aprobaciones federales y locales requeridas para iniciar la primera prueba en humanos de la terapia con células madre sanguíneas modificadas con CCR5. Está previsto que el ensayo clínico de Fase I, patrocinado por City of Hope y financiado por Sangamo BioSciences y CIRM bajo su mecanismo de financiación de Asociación Estratégica, comience a acumularse en el cuarto trimestre de 2014.