Interacciones viral-huésped que afectan la diferenciación neuronal de progenitores humanos

La infección congénita por citomegalovirus humano (HCMV) es una causa importante de anomalías estructurales del sistema nervioso central y alteraciones sensoriales en el recién nacido. Es probable que el momento de la infección, así como la variedad de células susceptibles en el momento de la infección, afecten la gravedad de la enfermedad. Un objetivo principal de nuestra investigación es comprender en alta resolución los efectos de la infección por HCMV en la especificación del linaje neuronal y la maduración de las células madre y progenitoras. El esclarecimiento de los genes y procesos celulares afectados servirá como base para estrategias terapéuticas para mejorar los efectos de la infección por HCMV en los recién nacidos. La importancia de nuestros estudios también se extiende al grave problema de la infección por HCMV en personas inmunocomprometidas, donde los receptores de alotrasplantes tienen un alto riesgo de enfermedad grave y rechazo de aloinjertos. Este problema potencial en la terapia con células madre ha recibido poca atención hasta el momento. El uso propuesto del trasplante de células madre en el tratamiento de lesiones neuronales y enfermedades neurodegenerativas, así como el trasplante de otros precursores específicos de órganos, hace que sea imperativo comprender cómo la infección diseminada por HCMV en receptores inmunodeprimidos afectará la función y la diferenciación de las células. El año pasado, hemos logrado avances significativos en el logro de los objetivos de este proyecto. Utilizamos células madre neurales pre-roseta primitivas (pNSC) derivadas de células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones químicamente definidas para estudiar las interacciones huésped-HCMV en el desarrollo neural temprano. La infección de pNSC con HCMV fue en gran medida ineficiente y no progresiva. Con una multiplicidad de infección (MOI) baja, observamos defectos graves con respecto a la proporción de células que expresan las principales proteínas tempranas inmediatas (IE) a pesar de una entrada viral óptima, lo que indica la existencia de un bloqueo de eventos previos a la IE específicos. Se encontró que la expresión de IE, incluso con MOI alta, estaba restringida a un subconjunto de células negativas para la expresión del marcador del prosencéfalo FORSE-1. El tratamiento de las pNSC con el agente caudalizante ácido retinoico rescató la expresión de IE, lo que sugiere que el microambiente del rombencéfalo podría ser más permisivo para la infección. Se descubrió que la transactivación de los genes virales tempranos estaba gravemente debilitada y la expresión de los genes tardíos era apenas detectable incluso con un MOI alto. La diferenciación de pNSC en células progenitoras neurales primitivas (pNPC) restauró la expresión de IE pero no la transactivación de genes tempranos y tardíos. El aumento del número de partículas virales superó esta barrera a la expresión genética temprana y, por lo tanto, permitió la expresión de genes tardíos en pNPC. En consecuencia, la propagación viral solo se observó con un MOI alto, pero se restringió en gran medida a un ciclo de replicación, ya que las células infectadas secundariamente no lograron expresar de manera eficiente los genes tempranos. Es de destacar que los viriones producidos en pNPC y pNSC estaban asociados exclusivamente a células. Finalmente, encontramos que los genomas virales podrían persistir en el cultivo de pNSC hasta un mes después de la infección a pesar de la ausencia de expresión detectable de IE mediante inmunofluorescencia. La expansión clonogénica de las pNSC infectadas reveló que la presencia de ADN viral y proteínas IE eran insuficientes para bloquear la división de la célula huésped, permitiendo así la supervivencia de los genomas virales a través de la división celular en lugar de la replicación viral. Estos resultados resaltan la compleja serie de obstáculos que el HCMV debe superar para infectar células madre neurales primitivas y sugieren que estas células podrían actuar como reservorio del virus. Para estudiar en mayor profundidad las bases moleculares de la interacción del HCMV con células del linaje neural, también hemos iniciado enfoques genómicos de alto rendimiento para analizar los microARN del HCMV, las alteraciones en los perfiles de expresión génica y de los microARN celulares, y los defectos globales en el empalme alternativo del huésped. en NPC derivados de pNSC infectados y no infectados. Curiosamente, aunque hay muchos cambios en la expresión genética de la célula huésped en las células infectadas, solo hubo una pequeña superposición con el conjunto de cambios que habíamos encontrado en los fibroblastos humanos infectados. Esto resalta la importancia de realizar estos estudios en los objetivos relevantes del virus en el feto en desarrollo. Esperamos que los resultados de estos estudios proporcionen una resolución sin precedentes de los efectos sobre la neurogénesis cuando el HCMV infecta a un recién nacido, sirvan como base para futuros esfuerzos terapéuticos para prevenir los defectos de nacimiento debidos al HCMV y brinden información sobre el grave problema potencial del HCMV diseminado en individuos inmunodeprimidos que reciben células madre alogénicas trasplantadas.

La infección congénita por citomegalovirus humano (HCMV) es una causa importante de anomalías estructurales del sistema nervioso central y alteraciones sensoriales en el recién nacido. Un objetivo principal de nuestra investigación es comprender en alta resolución los efectos de la infección por HCMV en la especificación del linaje neuronal y la maduración de las células madre y progenitoras. El esclarecimiento de los genes y procesos celulares afectados servirá como base para estrategias terapéuticas para mejorar los efectos de la infección por HCMV en los recién nacidos. La importancia de nuestros estudios también se extiende al grave problema de la infección por HCMV en personas inmunocomprometidas, donde los receptores de alotrasplantes tienen un alto riesgo de enfermedad grave y rechazo de aloinjertos. Este problema potencial en la terapia con células madre ha recibido poca atención hasta el momento. El uso propuesto del trasplante de células madre en el tratamiento de lesiones neuronales y enfermedades neurodegenerativas, así como el trasplante de otros precursores específicos de órganos, hace que sea imperativo comprender cómo la infección diseminada por HCMV en receptores inmunodeprimidos afectará la función y la diferenciación de las células. El año pasado, hemos logrado avances significativos en el logro de los objetivos de este proyecto. Utilizamos células madre neurales pre-roseta primitivas (pNSC) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) para estudiar las interacciones huésped-HCMV en el desarrollo neuronal temprano y descubrimos con varias líneas diferentes de pNSC derivadas de hESC que la infección por HCMV es ineficiente y no progresivo. La diferenciación de pNSC en células progenitoras neurales primitivas (pNPC) restauró parte de la expresión genética temprana viral, pero no la transactivación de genes tardíos. La alteración de la expresión de genes virales en pNSC no fue el resultado de una entrada viral ineficiente o de una importación nuclear de ADN viral, sino que se correlacionó con una importación nuclear deficiente de la proteína UL82 asociada al virión, que se cree que desempeña un papel en la eliminación de barreras para la síntesis de ARN viral. Además, encontramos que los genomas virales podrían persistir en el cultivo de pNSC hasta un mes después de la infección a pesar de la ausencia de expresión de genes líticos virales detectables, aunque también pudimos detectar la expresión de genes asociados a la latencia viral, lo que sugiere que el virus se vuelve latente en las pNSC. Para estudiar con mayor profundidad las bases moleculares de la interacción del HCMV con células del linaje neural, hemos continuado con enfoques genómicos de alto rendimiento para analizar los microARN del HCMV, las alteraciones en los perfiles de microARN celular y de expresión génica, y los defectos globales en el empalme alternativo del huésped en NPC derivados de pNSC infectados y no infectados. Descubrimos que en los NPC infectados, había una regulación negativa específica de las transcripciones relacionadas con la diferenciación neuronal. Estos hallazgos demuestran la capacidad de la infección por HCMV para alterar las identidades neuronales de células precursoras clave en el sistema nervioso en desarrollo. También analizamos nuestra base de datos NPC RNA-seq infectada en busca de diferencias en los patrones de poliadenilación del ARNm del huésped y descubrimos que más de cien transcripciones se alteraron significativamente en términos de su preferencia del sitio de escisión del extremo 3', y la mayoría de estos eventos resultaron en UTR 3' acortadas. . Nuestro hallazgo de que el HCMV induce cambios importantes en el transcriptoma de los NPC, particularmente a nivel de genes neuronales, sugirió que el virus podría afectar funcionalmente a estas células. Para evaluar esto directamente, diferenciamos las pNSC en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA) e infectamos estas células en diferentes momentos del proceso de diferenciación. La siembra de pNSC en medio de diferenciación durante 6 semanas produce una alta frecuencia de neuronas maduras con proyecciones axonales largas. La infección de pNSC al inicio de la diferenciación reduce en gran medida la generación de neuronas beta III-tubulina+ 4 semanas después y previene la diferenciación a neuronas MAP2+ maduras. La infección después de 1 semana de diferenciación también reduce la cantidad de neuronas beta III-tubulina+ y provoca una muerte celular masiva. La infección dos semanas después del inicio de la diferenciación no reduce el número de neuronas βIII-tubulina+ o MAP2+, pero las células muestran anomalías importantes. Dado que las neuronas son muy sensibles al estrés oxidativo y la infección por HCMV aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno en los fibroblastos, investigamos si se producía el mismo efecto en cultivos neuronales. Cuando se infectaron pNSC en la semana 4 después de la diferenciación, se detectaron altos niveles de ROS. Estos resultados sugieren que los efectos complejos de la infección por HCMV en diversas etapas de la diferenciación de las células neurales, tanto en la supervivencia como en la maduración celular, pueden explicar la amplia gama de defectos congénitos. Esperamos que los resultados de estos estudios proporcionen una resolución sin precedentes de los efectos sobre la neurogénesis cuando el HCMV infecta a un recién nacido, sirvan como base para futuros esfuerzos terapéuticos para prevenir los defectos de nacimiento debidos al HCMV y brinden información sobre el grave problema potencial del HCMV diseminado en individuos inmunodeprimidos que reciben células madre alogénicas trasplantadas.

La pérdida auditiva neurosensorial (SNHL) congénita e infantil es una enfermedad multifactorial que afecta gravemente la calidad de vida. La etiología más importante de la SNHL congénita es la infección prenatal por citomegalovirus humano (HCMV), que representa entre el 20 y el 30 % de todas las sordera en bebés y niños. Aproximadamente 1 de cada 150 niños nace con HCMV congénito, y 1 de cada 5 de estos niños nacerá con o desarrollará discapacidades neuronales permanentes, la más común de las cuales es la SNHL. La SNHL puede ser bilateral o unilateral y la gravedad de la pérdida auditiva y su progresión varían ampliamente. Aunque la asociación entre la infección congénita por HCMV y la SNHL se reconoce desde hace 50 años, se desconoce cómo la infección induce la pérdida auditiva. Dado que el objetivo del HCMV son las células del linaje neural, un objetivo principal de nuestra investigación es comprender en alta resolución los efectos de la infección por HCMV sobre la especificación del linaje neural y la maduración de las células madre y progenitoras. El esclarecimiento de los genes y procesos celulares afectados servirá como base para estrategias terapéuticas para mejorar los efectos de la infección por HCMV en los recién nacidos. La importancia de nuestros estudios también se extiende al problema de la infección por HCMV en personas inmunocomprometidas, donde los receptores de alotrasplantes tienen un alto riesgo de enfermedad grave y rechazo de aloinjertos. El uso propuesto del trasplante de células madre en el tratamiento de lesiones neuronales y enfermedades neurodegenerativas, así como el trasplante de otros precursores específicos de órganos, hace que sea imperativo comprender cómo la infección diseminada por HCMV en receptores inmunodeprimidos afectará la función y la diferenciación de las células. El año pasado, logramos avances significativos en el logro de los objetivos de este proyecto. Para estudiar con mayor profundidad las bases moleculares de la interacción del HCMV con células del linaje neural, continuamos con enfoques genómicos de alto rendimiento para analizar los microARN del HCMV, las alteraciones en los perfiles de microARN celular y de expresión génica, y los defectos globales en el empalme alternativo del huésped en infectados. y NPC no infectados derivados de pNSC. También analizamos nuestra base de datos NPC RNA-seq infectada en busca de diferencias en los patrones de poliadenilación del ARNm del huésped y descubrimos que más de cien transcripciones se alteraron significativamente en términos de su preferencia del sitio de escisión del extremo 3', y la mayoría de estos eventos resultaron en UTR 3' acortadas. . Uno de nuestros hallazgos más sorprendentes fue que hubo una expresión fuertemente mejorada de tres miARN que desempeñan un papel fundamental en el desarrollo auditivo. Otros genes implicados en el desarrollo coclear también fueron desregulados por la infección. Estos resultados implican un nuevo mecanismo molecular de daño al oído interno en desarrollo de niños con infección congénita, basado en una regulación genética alterada del desarrollo. Estos hallazgos, junto con nuestro éxito en inducir la diferenciación de ES humanos en progenitores óticos que pueden diferenciarse aún más en células similares a células ciliadas y neuronas auditivas inmaduras, han proporcionado una base sólida para investigar en profundidad la infección por HCMV de células progenitoras auditivas, con el objetivo de determinar cómo la infección compromete la expresión genética y la función de las células del oído interno derivadas de ES humanas y utilizar esta información para desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento y la prevención de la pérdida auditiva en niños con infección congénita. Lamentablemente, no podemos continuar con estos estudios tan importantes, ya que esta subvención del CIRM finalizó y no se financió una nueva propuesta para el CIRM. Esto fue muy decepcionante porque hay un vacío en la cartera de subvenciones otorgadas por CIRM, que es una falta de atención a problemas importantes relacionados con la salud infantil. Una de las áreas más importantes de las células madre que se ha descuidado es la pérdida auditiva neurosensorial congénita. El CIRM sólo ha concedido tres subvenciones relacionadas con la pérdida auditiva. Sin embargo, la incidencia de pérdida auditiva congénita (sin incluir la pérdida auditiva por otras causas o asociada con el envejecimiento) es de 400 de cada 100,000 recién nacidos. Además, la discapacidad durará toda la vida, lo que provocará una carga importante para el paciente y su familia y un alto coste económico para la sociedad. No existe ningún medicamento o vacuna para prevenir la pérdida auditiva congénita debida al CMV y, por lo tanto, es esencial desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, incluidas células madre, orientación genética y descubrimiento de fármacos. Desafortunadamente, no existe un mecanismo aceptado por el cual la infección por HCMV provoque pérdida de audición, y la falta de conciencia pública sobre los graves problemas médicos resultantes de la infección congénita por HCMV ha dificultado la obtención de apoyo para estudios que identifiquen una etiología. Agradecemos el apoyo que ha brindado el CIRM y esperamos que en el futuro haya suficiente conciencia pública sobre los efectos devastadores de la infección congénita por HCMV para presionar a las agencias de financiación para que reconozcan y apoyen esta importante investigación.