Más de veinte enfermedades genéticas humanas son causadas por la expansión de secuencias repetidas de trinucleótidos simples dentro de genes esenciales, lo que da como resultado proteínas tóxicas (como en las enfermedades por expansión de poliglutamina, como la enfermedad de Huntington (EH)), ARN tóxicos (como en la distrofia miotónica tipo 1), o represión genética (como en la ataxia de Friedreich (FRDA) y el síndrome de X frágil (FXS)). Nuestros laboratorios han generado células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington (HD), síndrome de X frágil (FXS), distrofia miotónica tipo 1 (DM1) y ataxia de Friedreich (FRDA). Al comparar las células antes y después de la reprogramación, encontramos que las repeticiones tripletes se expandieron en las iPSC FRDA y DM1, pero no en las iPSC HD. Durante el crecimiento de las iPSC en cultivo, las repeticiones continúan expandiéndose, lo que sugiere que la expansión podría estar relacionada con la replicación del ADN en estas células. La expansión que observamos en las iPSC no ocurre en los fibroblastos (células de la piel) de los que se derivaron las iPSC. De manera similar, al diferenciarse las iPSC de FRDA en neuronas (células cerebrales), se detiene la expansión repetida. Esta observación sugiere que algunos factores celulares necesarios para la expansión pueden expresarse selectivamente en las iPSC, pero no en los fibroblastos o las neuronas.
Durante el año pasado, nuestros estudios tuvieron como objetivo comprender la base molecular subyacente a la expansión/inestabilidad de las repeticiones tripletes que hemos observado durante el establecimiento y la propagación de iPSC a partir de fibroblastos específicos de la enfermedad. Estudios anteriores han implicado a las enzimas reparadoras de errores de coincidencia (MMR) en la expansión repetida en modelos de ratón para EH y DM1. Encontramos que el silenciamiento del gen MSH2, que codifica una de las subunidades de las enzimas MMR, impide la expansión repetida en las iPSC FRDA humanas. Encontramos que los componentes del sistema de reparación de errores de coincidencia (MMR) humanos están asociados con los alelos de la enfermedad en las iPSC FRDA y DM1, y que el silenciamiento de estos genes a nivel de sus ARN mensajeros es suficiente para suprimir la expansión repetida. Además, hemos monitoreado los niveles de las enzimas MMR en fibroblastos, iPSC y neuronas y, como se esperaba, estas enzimas están presentes en cantidades más altas en las iPSC, lo que sugiere que es la disponibilidad de estas enzimas en las iPSC la que puede ser responsable de la expansión repetida. .
Deseamos determinar si es la estructura del ADN de las repeticiones de tripletes o el reconocimiento de proteínas de las repeticiones lo que recluta las enzimas MMR para repeticiones de tripletes en iPSC. Con este fin, utilizamos una serie de sondas de moléculas pequeñas que pueden diseñarse para apuntar a secuencias de ADN particulares en el genoma humano, y encontramos que una molécula que apunta a las repeticiones GAA-TTC en el gen de la frataxina FRDA desplaza las enzimas MMR y previene la repetición. expansión. Actualmente estamos explorando el mecanismo por el cual esta molécula desplaza a las enzimas MMR. Una comprensión más profunda de los eventos moleculares que conducen a la expansión repetida de los genes celulares endógenos responsables de estas enfermedades probablemente conducirá al descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas para estos trastornos actualmente intratables.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Durante el año pasado, nuestros esfuerzos de investigación se centraron en la generalidad de los resultados que encontramos en células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de pacientes con la enfermedad neurodegenerativa ataxia de Friedreich (FRDA). FRDA es una de las enfermedades de repetición de trinucleótidos (TNR), y nuestro principal hallazgo anterior fue que las repeticiones de trinucleótidos GAA•TCC que causan que FRDA se expandan durante el aislamiento y la propagación de las hiPSC de FRDA. Se demostró que esta expansión depende de enzimas que participan en la reparación de desajustes en el genoma humano. Para ampliar estos estudios, ahora nos hemos centrado en las hiPSC de las enfermedades TNR relacionadas, la distrofia miotónica, la enfermedad de Huntington y el síndrome de X frágil. La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una distrofia muscular dominante hereditaria causada por repeticiones tripletes CTG•CAG expandidas en la UTR 3' del gen DMPK1, que produce un ARN CUG tóxico con ganancia de función. Se ha demostrado que la gravedad de los síntomas de la enfermedad, la edad de aparición y la progresión están relacionadas con la duración de las repeticiones del triplete. Sin embargo, los mecanismos de la inestabilidad de repetición del triplete CTG•CAG no se comprenden completamente. Se generaron células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas a partir de fibroblastos de pacientes con DM1 y enfermedad de Huntington (EH). Aislamos 41 clones de iPSC de fibroblastos DM1, todos mostrando diferentes longitudes de repetición CTG•CAG, lo que demuestra inestabilidad somática dentro de la población de fibroblastos inicial. Durante la propagación de las iPSC, las repeticiones se expandieron de manera análoga a la expansión intergeneracional observada en las familias de pacientes con DM1. La correlación entre la longitud de las repeticiones y la tasa de expansión identificó el intervalo entre 57 y 126 repeticiones como un umbral de longitud importante donde las tasas de expansión aumentaron dramáticamente. Además, las repeticiones más largas mostraron una expansión de repetición triplete más rápida. Las repeticiones relativamente cortas del gen responsable de la enfermedad de Huntington están por debajo de este umbral y, por tanto, no se expanden en las iPSC. La tendencia general de las repeticiones tripletes a expandirse cesó con la diferenciación en cuerpos embrioides diferenciados o neuroesferas. Los componentes de reparación de desajustes MSH2, MSH3 y MSH6 se expresaron altamente en las iPSC en comparación con los fibroblastos, y solo ocuparon el gen DMPK1 que alberga repeticiones de triplete CTG·CAG más largas. Además, el silenciamiento por shRNA de MSH2 impidió la expansión de repetición del triplete CTG•CAG. También hemos generado líneas hiPSC de siete sujetos masculinos clínicamente diagnosticados con síndrome de X frágil. Estas hiPSC se han caracterizado minuciosamente con respecto a la pluripotencia, el estado de metilación del ADN en el gen FMR1, la longitud de repetición CGG, la expresión de FMR1 y la diferenciación neuronal. La información obtenida de estos estudios proporciona nuevos conocimientos sobre un mecanismo general de expansión de repeticiones tripletes en las iPSC.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Durante el año pasado, nuestros esfuerzos de investigación se centraron en la generalidad de los resultados que encontramos en células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de pacientes con la enfermedad neurodegenerativa ataxia de Friedreich (FRDA). FRDA es una de las enfermedades de repetición de trinucleótidos (TNR), y nuestro principal hallazgo anterior fue que las repeticiones de trinucleótidos GAA•TCC que causan que FRDA se expandan durante el aislamiento y la propagación de las hiPSC de FRDA. Se demostró que esta expansión depende de enzimas que participan en la reparación de desajustes en el genoma humano. Para ampliar estos estudios, nos hemos centrado en las hiPSC de las enfermedades TNR relacionadas, distrofia miotónica tipo 1 (DM1), enfermedad de Huntington (HD), síndrome de X frágil (FXS) y distrofia corneal endotelial de Fuchs (FECD). La DM1 es una distrofia muscular hereditaria dominante causada por repeticiones tripletes CTG·CAG expandidas en el gen DMPK, que produce un ARN CUG tóxico con ganancia de función. Se ha demostrado que la gravedad de los síntomas de la enfermedad, la edad de aparición y la progresión están relacionadas con la duración de las repeticiones del triplete. Sin embargo, los mecanismos de la inestabilidad de repetición del triplete CTG•CAG no se comprenden completamente. Las hiPSC se generaron a partir de fibroblastos de pacientes con DM1 y EH. De manera similar a nuestros resultados en FRDA, las hiPSC DM1 muestran inestabilidad repetida y la expansión repetida depende nuevamente del sistema de reparación de errores de coincidencia del ADN. Definimos un umbral de longitudes de repetición donde se produce la expansión repetida. Las repeticiones relativamente cortas del gen responsable de la enfermedad de Huntington están por debajo de este umbral y, por tanto, no se expanden en las iPSC. También hemos generado líneas hiPSC de siete sujetos masculinos clínicamente diagnosticados con síndrome de X frágil. Estas hiPSC se han caracterizado minuciosamente con respecto a la pluripotencia, el estado de metilación del ADN en el gen FMR1, la longitud de repetición CGG, la expresión de FMR1 y la diferenciación neuronal. En estudios recientes, hemos centrado nuestra atención en la enfermedad ocular común FECD, donde aproximadamente el 75% de los pacientes caucásicos tienen una repetición triplete CTG·CAG en un intrón del gen que codifica el factor de transcripción esencial TCF4. Encontramos inestabilidad repetida en fibroblastos de fibroblastos de pacientes con FECD y expansión repetida en las hiPSC correspondientes. Es importante destacar que, al igual que DM1 con la misma secuencia repetida que en FECD, el mecanismo patológico en ambas enfermedades parece ser similar, a saber, la toxicidad del ARN causada por el secuestro de factores esenciales de procesamiento del ARN mensajero. También hemos identificado una posible molécula terapéutica pequeña que se une a las repeticiones tripletes de CTG•CAG y actualmente estamos probando esta molécula en los tipos de células derivadas de iPSC de pacientes relevantes. La información obtenida de estos estudios proporciona nuevos conocimientos sobre un mecanismo general de expansión de repeticiones tripletes en las iPSC y ha revelado un nuevo enfoque terapéutico para estas enfermedades.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Inestabilidad de repetición triplete en iPSC humanas
Resumen público:
Más de veinte enfermedades genéticas humanas son causadas por la expansión de secuencias simples de ADN compuestas de repeticiones de tres nucleótidos (como CAG, CTG, CGG y GAA) dentro de genes esenciales. Estas repeticiones pueden ocurrir dentro de la región de un gen que codifica la proteína, lo que generalmente da como resultado proteínas con grandes extensiones de repeticiones de un solo aminoácido, como las series de glutamina. Estas proteínas son tóxicas, provocan la muerte de tipos específicos de células cerebrales y provocan enfermedades como la enfermedad de Huntington (EH) y muchas de las ataxias espinocerebelosas (un tipo de trastorno del movimiento). Otras repeticiones pueden estar en regiones de genes que no codifican la proteína en sí, pero que se copian en el ARN mensajero, que es una copia del gen que sirve para generar la proteína. Estos ARN con repeticiones expandidas también son tóxicos para las células y, a veces, secuestran proteínas celulares esenciales. Un ejemplo de este tipo de enfermedad es la distrofia miotónica tipo 1, una forma de distrofia muscular. Por último, hay dos ejemplos de trastornos por repetición en los que las repeticiones silencian los genes que albergan estas mutaciones: la ataxia de Friedreich (FRDA) y el síndrome de X frágil (FXS). Una limitación en el desarrollo de fármacos para tratar estas enfermedades es la falta de modelos celulares apropiados que representen los tipos de células afectadas en estas enfermedades humanas. Con la llegada de la tecnología para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células de la piel de pacientes y nuestra capacidad de convertir las iPSC en cualquier tipo de célula, como neuronas (células cerebrales) que se ven afectadas en estas enfermedades de repetición triplete, estos modelos celulares se están volviendo cada vez más disponible. Nuestros laboratorios han generado iPSC a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes con HD, FXS y FRDA. Al comparar las células antes y después de la reprogramación, encontramos que las repeticiones tripletes se expandieron en las iPSC FRDA, pero no en las iPSC HD. Esta aplicación tiene como objetivo comprender las bases moleculares subyacentes a la expansión/inestabilidad de las repeticiones tripletes que hemos observado durante el establecimiento y propagación de iPSC a partir de fibroblastos específicos de enfermedades. Si bien los sistemas artificiales con construcciones de genes informadores han reproducido la expansión repetida de tripletes en bacterias, levaduras y células de mamíferos, no se ha informado previamente de ningún modelo celular que recapitule las expansiones repetidas en los genes celulares endógenos involucrados en estas enfermedades. Por lo tanto, nuestras observaciones de que se encuentra expansión repetida en las iPSC de FRDA brindan la primera oportunidad de analizar los mecanismos involucrados en la expansión a nivel molecular para los genes celulares auténticos en su entorno natural de cromatina. La expansión repetida es la base central de estas enfermedades, sin importar cuál sea el resultado de la expansión (proteína tóxica o ARN o silenciamiento de genes), y una comprensión más completa de cómo se expanden las repeticiones puede conducir a nuevos medicamentos para tratar estas enfermedades.
Declaración de beneficio para California:
Un obstáculo importante en el desarrollo de nuevos medicamentos para enfermedades humanas es la falta de modelos celulares que representen los tejidos u órganos afectados por estas enfermedades. Ejemplos de estas enfermedades son las enfermedades neurodegenerativas de triple repetición, como la enfermedad de Huntington, las ataxias espinocerebelosas, las formas de distrofia muscular, el síndrome de X frágil y la ataxia de Friederich. Estas enfermedades, aunque relativamente raras en comparación con el cáncer o las enfermedades cardíacas, afectan a miles de personas en California. Los avances recientes en la biología de las células madre permiten ahora generar células que reflejen los tipos de células en riesgo en estas enfermedades (como las células cerebrales, cardíacas y musculares), a partir de células de la piel del paciente. Las células de la piel se pueden convertir en células similares a células madre (células madre pluripotentes inducidas o iPSC), que luego pueden dar lugar a casi cualquier tipo de célula en el cuerpo humano. Durante el curso de nuestros estudios, descubrimos que las iPSC derivadas de células de la piel de pacientes con ataxia de Friedreich imitan el comportamiento de la mutación genética en esta enfermedad. Una repetición simple de la secuencia de ADN GAA se encuentra en el gen que codifica una proteína esencial llamada frataxina, y esta repetición aumenta en longitud entre generaciones en familias humanas que portan esta mutación. Por encima de cierto umbral, las repeticiones silencian este gen. También se sabe que las repeticiones se expanden en las células cerebrales de personas con esta enfermedad. Con la llegada de las iPSC y las neuronas derivadas de pacientes, ahora tenemos sistemas modelo humanos en los que estudiar los mecanismos responsables de la expansión repetida. Ya hemos identificado un conjunto de proteínas involucradas en la expansión de repeticiones y ahora deseamos profundizar más en cómo se expanden las repeticiones. De esta manera, podremos identificar nuevos objetivos para el desarrollo de fármacos. Ampliaremos nuestros estudios a la enfermedad de Huntington y al síndrome de X frágil. Hemos identificado dos posibles enfoques terapéuticos para la ataxia de Friedreich e identificado moléculas que reactivan el gen silencioso o bloquean la expansión repetida. Nuestros estudios en enfermedades relacionadas también pueden proporcionar posibles estrategias terapéuticas para estos otros trastornos, que serán beneficiosas para los pacientes que padecen estas enfermedades, tanto en California como en todo el mundo.
