El objetivo del proyecto es definir el papel de los reguladores clave de la pluripotencia y la diferenciación en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). El trabajo completado en el primer período de este proyecto se centró en un regulador llamado TCF-3. Se sabe que el papel de este factor en cultivos de células madre embrionarias de ratón es un regulador clave que ayuda a definir el estado pluripotente de una manera muy importante: la pérdida de la proteína TCF-3 da como resultado un estado refractario de pluripotencia e incapacidad para diferenciarse. Se desconocen las características moleculares y celulares de TCF-3 y su función en ESC e iPSC humanas. Por lo tanto, no se sabe si el TCF-3 humano realiza funciones en hESC y hiPSC que son similares a sus funciones en ESC de ratón. El trabajo realizado durante el primer período de financiación se centró en definir las propiedades básicas de la expresión de proteínas y ARNm de TCF-3 humano en diferentes condiciones de cultivo: experimentos preparatorios que nos permitirán definir sus funciones. Se establecieron múltiples condiciones que permiten el mantenimiento de un estado de células madre embrionarias, o condiciones que promueven la diferenciación en diferentes linajes de destino celular. Se desarrollaron herramientas biológicas para estudiar el ARNm y la proteína de TCF-3 en esas condiciones, incluidas herramientas para reintroducir TCF-3 mutante y modificado con proteínas y reactivos para eliminar el ARNm y la proteína de TCF-3 de las células hESC. Se obtuvieron los siguientes resultados: i) TCF 3 se expresa y es activo como regulador negativo, ii) la proteína TCF-3 se modifica mediante escisión de proteínas y modificaciones covalentes, iii) TCF-3 es un importante regulador de genes de diferenciación. Estos datos sugieren que TCF-3 es un modulador importante de las células madre y su diferenciación. Si bien esto podría implicar que TCF-3 realiza funciones similares en ESC de ratón y humano, observamos diferencias en los genes regulados y en los fenotipos de colonias de hESC cuando se modifican los niveles de TCF-3. Estas observaciones sugieren que existen diferencias importantes en la función de TCF-3 que lo distinguen de su contraparte en ESC de ratón. Se han diseñado experimentos para probar esta hipótesis y definir cómo se establecen las diferencias aparentes del TCF-3 humano a nivel de señalización molecular y celular.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
El objetivo del proyecto es definir el papel de los reguladores clave de la pluripotencia y la diferenciación en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). En concreto, este proyecto se centró en la regulación y actuaciones del TCF-3. Se sabe que el papel de este factor en cultivos de células madre embrionarias de ratón protege el estado pluripotente y la capacidad de respuesta celular de una manera muy importante: la pérdida de la proteína TCF-3 da como resultado un estado permanente de pluripotencia e incapacidad para diferenciarse. Sin embargo, no se conocen las características moleculares y celulares de TCF-3 y su función en hESC e iPSC, ni si sus funciones son similares a sus funciones en ESC de ratón. El trabajo realizado en el segundo período de financiación se centró en mapear modificaciones proteicas clave de TCF-3, incluida la fosforilación. La fosforilación es un método utilizado con frecuencia para modificar las acciones de las proteínas, ya sea para inhibir la actividad de las proteínas, estimularla o cambiar la capacidad de interactuar con otras proteínas. Se modificaron líneas de células madre embrionarias humanas para expresar una versión marcada de TCF-3 para un rápido aislamiento y purificación a partir de extractos celulares. La purificación se realizó rápidamente y en condiciones especializadas para evitar la pérdida de modificaciones de proteínas. La espectrometría de masas identificó múltiples sitios de fosforilación y otras formas de modificación de proteínas. El trabajo durante este período también se centró en el desarrollo de estrategias para identificar genes diana clave regulados por TCF-3. Se desarrollaron y validaron métodos para eliminar TCF-3 de las hESC en niveles que garanticen una eliminación genuina sin efectos artefactos en las hESC. Se utilizará la eliminación de TCF-3 o "derribo" para investigar cómo se enfrentan las hESC en ausencia de TCF-3. Los resultados preliminares sugieren que TCF-3 ejerce control sobre un conjunto de reguladores genéticos, así como sobre señales celulares. Para estos experimentos, sólo se evaluaron los eventos tempranos e inmediatos que ocurren tras la eliminación de TCF-3. Centrarse en los acontecimientos tempranos es un esfuerzo decidido para identificar medidas regulatorias clave de reacción inmediata. Los resultados sugieren que la expresión de TCF-3 es dinámica, constitutivamente requerida y que gran parte de su función es proporcionar acciones represivas. Si bien esto tiene una similitud general con el papel atribuido a TCF-3 en las células madre embrionarias de ratón, parece que los tipos de genes y procesos reprimidos por TCF-3 son distintos en hESC.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
El objetivo del proyecto es definir el papel de los reguladores clave de la pluripotencia y la diferenciación en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). En concreto, este proyecto se centró en la regulación y actuaciones del TCF-3. Se sabe que el papel de este factor en cultivos de células madre embrionarias de ratón protege el estado pluripotente y la capacidad de respuesta celular de una manera muy importante: la pérdida de la proteína TCF-3 da como resultado un estado permanente de pluripotencia e incapacidad para diferenciarse. Sin embargo, se desconocen las características moleculares y celulares de TCF-3 y su función en las hESC. No se sabe si las funciones del TCF-3 son similares a sus funciones en el ESC del mouse. Los trabajos realizados en el tercer periodo de financiación se centraron en definir los genes que están modulados por la expresión de TCF-3. El análisis de microarrays de todo el genoma se realizó en presencia y ausencia de TCF-3 y en presencia y ausencia de condiciones de diferenciación. La eliminación de TCF-3, o "derribo", reveló un pequeño conjunto específico de genes que dependen dinámicamente de TCF-3 para su expresión. Se utilizaron señales de diferenciación que imitan el entorno en el embrión en desarrollo para comprender cómo funciona TCF-3 en este entorno. Los datos preliminares sugieren que TCF-3 ejerce una función fuerte y notable dentro del nuevo contexto de señalización. Se están utilizando análisis de microarrays adicionales, validación y confirmación bioquímica para complementar los estudios de microarrays y definir mejor el papel preciso de la acción de TCF-3. Los resultados sugieren que la expresión de TCF-3 es dinámica, constitutivamente requerida y que gran parte de su función es proporcionar acciones represivas. Si bien esto tiene una similitud general con el papel atribuido a TCF-3 en las células madre embrionarias de ratón, parece que los tipos de genes y procesos reprimidos por TCF-3 son distintos en hESC.
Período de información:
Año 4/NCE
El objetivo del proyecto es definir el papel de los reguladores clave de la pluripotencia y la diferenciación en células madre embrionarias humanas (hESC). En concreto, este proyecto se centró en la regulación y acciones del regulador de expresión génica TCF-3. Se sabe que el papel de este factor en cultivos de células madre embrionarias de ratón protege el estado pluripotente y la capacidad de respuesta celular de una manera muy importante: la pérdida de la proteína TCF-3 da como resultado un estado permanente de pluripotencia e incapacidad para diferenciarse. Sin embargo, se desconocen las características moleculares y celulares de TCF-3 y su función en las hESC. No se sabe si las funciones del TCF-3 son similares a sus funciones en el ESC del mouse. Los trabajos realizados en el tercer periodo de financiación se centraron en definir los genes que están modulados por la expresión de TCF-3. El análisis de microarrays de todo el genoma se realizó en presencia y ausencia de TCF-3 y en presencia y ausencia de condiciones de diferenciación. La eliminación de TCF-3, o "derribo", reveló un pequeño conjunto específico de genes que dependen dinámicamente de TCF-3 para su expresión. Se utilizaron señales de diferenciación que imitan el entorno en el embrión en desarrollo para comprender cómo funciona TCF-3 en este entorno. Nuestros datos sugieren que TCF-3 ejerce una función represiva fuerte dentro del nuevo contexto de señalización. Se han utilizado análisis de microarrays, validación y confirmación bioquímica para definir mejor el papel preciso de la acción de TCF-3. El año pasado se utilizó el enfoque ChIP-seq para definir con precisión el patrón de ocupación del genoma que tiene TCF-3 en cultivos de hESC antes de la diferenciación. Los resultados sugieren que la expresión de TCF-3 es dinámica, constitutivamente requerida y que gran parte de su función es proporcionar acciones represivas. Si bien esto tiene una similitud general con el papel atribuido a TCF-3 en las células madre embrionarias de ratón, parece que los tipos de genes y procesos reprimidos por TCF-3 son distintos en hESC.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
TCF-3: un efector de la vía Wnt y un regulador nanog en la autorrenovación de células madre pluripotentes
Resumen público:
A pesar del enorme potencial de las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) para el desarrollo de nuevos tratamientos para enfermedades humanas, todavía existen lagunas importantes en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que regulan el establecimiento y mantenimiento del estado pluripotente. . Una mejor comprensión de los mecanismos fundamentales que regulan la pluripotencia podría mejorar la capacidad de establecer células madre pluripotentes, entendiendo cómo mantenerlas en estado indiferenciado y cómo diferenciarlas en linajes celulares específicos. La investigación propuesta aquí busca proporcionar una comprensión fundamentalmente mejor de la pluripotencia y cómo se controla en las células hES y las iPC estrechamente relacionadas. Se sabe que el mantenimiento de las células madre está controlado por un grupo de proteínas centrales que las mantienen en un estado indiferenciado. Cuando estas proteínas se regulan a la baja, se diferencian en tipos de células especializadas. Poco se sabe acerca de cómo se regula el circuito regulador maestro, aparte de la interacción positiva entre los tres factores reguladores centrales. Aquí proponemos estudiar otra proteína que interactúa con estas proteínas reguladoras centrales y que puede ser un regulador clave de su actividad. Estos estudios pueden ampliar nuestra definición del circuito regulador central de las células madre. A través de la investigación propuesta aquí obtendremos una mejor comprensión de los procesos moleculares que funcionan cuando las células ES pluripotentes deciden comprometerse con una diferenciación específica de linaje. Por ejemplo, ¿qué genes deben activarse o desactivarse para lograr la diferenciación en linajes específicos? ¿Cómo contribuyen las modificaciones de la cromatina a esta regulación? Esto podría conducir a mejoras en el cultivo de células hES y en los métodos para producir iPSC. Una mejor comprensión de estas características podría ayudar a controlar mejor estas células para su uso en medicina regenerativa. Dado que las células hES se derivan del embrión humano, estos estudios también aportarán conocimientos importantes sobre el desarrollo embrionario humano previo a la implantación.
Declaración de beneficio para California:
Un objetivo principal de la Propuesta 71 es trasladar la investigación básica con células madre a aplicaciones clínicas. La discapacidad y la pérdida del poder adquisitivo y de la libertad personal resultantes de una enfermedad o trastorno son devastadoras y crean una carga financiera para California, además del sufrimiento causado a los pacientes y sus familias. Las terapias que utilizan células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas relacionadas (hiPSC) tienen el potencial de cambiar millones de vidas. El uso de hESC y hiPSC como modelos de enfermedad nos ayudará a comprender las causas subyacentes de la enfermedad y probablemente ayudará en el desarrollo de medicamentos para tratar esas enfermedades. Sin embargo, para aprovechar el potencial de estas células, necesitamos comprender mejor cómo se pueden cultivar y qué factores regulan el crecimiento y la autorrenovación de la población de células madre. El mantenimiento de las células madre en un estado indiferenciado sigue siendo problemático y el crecimiento a largo plazo de las células madre puede estar asociado con la aparición de alteraciones genéticas, algunas de las cuales se han asociado previamente con el desarrollo del cáncer. Además, comprender los mecanismos que regulan el crecimiento de las células madre será importante no sólo para mantenerlas sino también para comprender cómo impulsar su diferenciación en células más especializadas. Finalmente, comprender los factores que respaldan el crecimiento de las células madre será importante para comprender los riesgos de trasplantar células madre y sus derivados diferenciados a los pacientes. Por lo tanto, la razón de ser de la investigación propuesta es proporcionar una comprensión fundamentalmente mejor de cómo crecen y se renuevan las hESC y las hiPSC. Los beneficios previstos de nuestra investigación para los ciudadanos de California incluyen: 1. Desarrollo de métodos mejorados para cultivar células madre pluripotentes y desarrollar nuevos tratamientos basados en células para una variedad de enfermedades y trastornos. 2. Desarrollar una mejor comprensión de los riesgos del trasplante de células derivadas de células madre a pacientes y, por lo tanto, mejorar la seguridad del trasplante de células madre. 4. Métodos mejorados para comprender el desarrollo normal del embrión temprano 6. Transferencia de nuevas tecnologías y propiedad intelectual al ámbito público con los consiguientes ingresos de propiedad intelectual que ingresan al estado 7. Creación de nuevas empresas derivadas de biotecnología basadas en la propiedad intelectual generada 8. Creación de nuevos puestos de trabajo en el sector biotecnológico. Se prevé que, a largo plazo, el retorno para el Estado en términos de ingresos, beneficios de salud para sus ciudadanos y creación de empleo será significativo.
