El potencial de las células madre, como las células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), ha sido ampliamente reconocido para la terapia de reemplazo celular, modelando enfermedades humanas y sirviendo como plataforma para la detección y validación de fármacos. En esta subvención, propusimos utilizar el síndrome de Rett como prueba de principio, para establecer un paradigma de xenoinjerto de células humanas (es decir, trasplantar células humanas en embriones de ratón/rata) y realizar análisis in vivo para estudiar las características de neurotransmisión de humanos normales y enfermos. neuronas. Inicialmente determinamos que era factible utilizar la construcción lentiviral CamKII-ChR2 para impulsar la expresión neuronal excitadora específica de ChR2 en neuronas piramidales del hipocampo de ratón, así como en neuronas derivadas de células madre embrionarias humanas. Es importante destacar que hemos descubierto que tanto las neuronas del hipocampo de ratón que expresan ChR2 como las neuronas humanas derivadas de células madre embrionarias pueden aumentar los potenciales de acción cuando se estimulan in vitro, lo que indica que ChR2 expresado exógenamente es funcional. Además, trasplantamos con éxito células madre/progenitoras neurales derivadas de células madre embrionarias humanas en el cerebro anterior de rata fetal en el día embrionario 17. Nuestro análisis de los animales receptores en el día posnatal 21 mostró que aproximadamente entre el 40% y el 50% de las células sobrevivieron y comenzaron a expresar neuronas. marcadores, como NeuN, que indican la diferenciación neuronal, así como la supervivencia a largo plazo, de células humanas trasplantadas en los animales receptores. Como se propuso originalmente, procederemos con la documentación del fenotipo in vivo de las neuronas enfermas con síndrome de Rett. Nuestro enfoque será particularmente crucial no solo para validar fármacos candidatos u otras intervenciones terapéuticas para tratar el síndrome de Rett utilizando neuronas de Rett humanas xenotrasplantadas, sino también para estudiar el comportamiento in vivo de esas neuronas con y sin la intervención terapéutica.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Las células madre, como las células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), tienen un gran potencial para la terapia de reemplazo celular, el modelado de enfermedades humanas y la detección de fármacos. Propusimos utilizar el síndrome de Rett (RTT) como prueba de principio para establecer un paradigma de xenoinjerto de células humanas (es decir, trasplantar células humanas en cerebros de ratón/rata) para estudiar la función de neuronas humanas normales y enfermas in vivo. Durante el segundo año de financiación, obtuvimos nuevos conocimientos sobre las características electrofisiológicas de las neuronas RTT. Específicamente, encontramos que el fenotipo de neurotransmisión de las neuronas derivadas de iPSC específicas de pacientes RTT dependía en gran medida de los circuitos. Por otro lado, cuando se midieron las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de las células, se observaron anomalías extremadamente estables en los perfiles de potencial de acción, potenciales de membrana en reposo, etc., indicativos de la validez del sistema de cultivo. Dado que actualmente los científicos tienen un control muy limitado sobre las características de las conexiones neuronales formadas en condiciones de cultivo, nuestros hallazgos hacen que la evaluación in vivo de las propiedades neuronales RTT sea aún más deseable, porque las características de los circuitos son más adaptables in vivo, con señales anatómicas. A la luz de los hallazgos in vitro antes mencionados, centramos nuestra atención en las características electrofisiológicas intrínsecas de las células de las neuronas RTT, así como en su conectividad o propiedades de red neuronal, después de que las neuronas se integraran en los circuitos del huésped in vivo después del xenotrasplante. Nuestros datos preliminares demostraron que las anomalías del potencial de acción de las neuronas RTT se conservan in vivo después del xenotrasplante. Hasta ahora hemos establecido un sistema relativamente optimizado para estudiar neuronas RTT derivadas de iPSC humanas integradas en cerebros de ratones. Estamos preparados para descubrir no solo las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de las neuronas sino también la conectividad de las neuronas de tipo salvaje y RTT con los circuitos del huésped. Además, hemos logrado avances sustanciales con respecto a una tecnología novedosa, es decir, perfiles de expresión genética de una sola neurona junto con registros electrofisiológicos tanto in vitro como in vivo. Hasta ahora, se perfilaron 2 neuronas derivadas de RTT iPSC mediante secuenciación de ARN siguiendo registros electrofisiológicos, y ya se han revelado algunas pistas interesantes. Actualmente estamos recolectando más neuronas y esperamos hacer descubrimientos sin precedentes con conocimientos mecanicistas sobre la fisiopatología de la enfermedad RTT, lo que facilitará el desarrollo de nuevas terapias para la RTT. Este paradigma también es generalmente aplicable para estudiar otros trastornos neurológicos.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Durante la última década, tanto el público en general como la comunidad científica han apreciado mucho la importancia de las células madre para la terapia de reemplazo celular, el modelado de enfermedades humanas y las pruebas de toxicidad/terapia de fármacos. En nuestra aplicación que utiliza células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas (iPSC), propusimos utilizar el síndrome de Rett (RTT) como prueba de principio para establecer un paradigma de xenoinjerto de células humanas (es decir, trasplantar células humanas en cerebros de ratón/rata). estudiar la función de neuronas humanas normales y enfermas in vivo. Si bien aumentamos nuestro conocimiento sobre las características electrofisiológicas de las neuronas RTT durante la financiación del Año 2, durante el Año 3 del programa nos centramos principalmente en el trasplante de células normales y enfermas, así como en las firmas moleculares de las células trasplantadas a nivel de una sola célula. período de financiación. Después de nuestros experimentos iniciales de trasplante, observamos agrupación de las células trasplantadas en el lugar de la inyección, a pesar de que había varias células que se integraban en los cerebros del huésped. Para evitar este problema y responder a nuestras preguntas originales, desarrollamos un enfoque alternativo. Específicamente, adoptamos la metodología del "cerebro transparente" para visualizar mejor la integración y las proyecciones de las células trasplantadas, así como los circuitos en los que participan, en el entorno del huésped para revelar la conectividad de las neuronas de tipo salvaje y RTT con los circuitos del huésped. . Con este método, podemos seguir las neuronas RTT trasplantadas a mayor resolución -sin las limitaciones de los enfoques convencionales- para estudiar neuronas RTT derivadas de iPSC humanas integradas en cerebros de ratones. Como parte de nuestro último objetivo específico, hemos realizado perfiles de expresión genética de una sola neurona junto con registros electrofisiológicos tanto in vitro como in vivo. Específicamente, implementamos registros electrofisiológicos de las neuronas derivadas de RTT iPSC trasplantadas y aislamos el material genómico de la misma célula para realizar análisis del transcriptoma. Recopilamos una cantidad significativa de datos de experimentos de secuenciación de ARN y hemos estado realizando análisis bioinformáticos relevantes. Para completar el análisis del perfil de expresión genética, obtuvimos una extensión sin costo del proyecto y, una vez finalizado el período de extensión sin costo, se presentará el informe correspondiente que describe los resultados del análisis del transcriptoma de una sola neurona junto con con electrofisiología. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan información mecanística sobre la fisiopatología de la enfermedad RTT, lo que facilitará el desarrollo de nuevas terapias para la RTT. Por último, nuestro enfoque es aplicable para estudiar otros trastornos neurológicos además del RTT.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Estudio de la neurotransmisión de neuronas derivadas de células ES humanas normales y enfermas in vivo
Resumen público:
Las células madre, incluidas las células madre embrionarias humanas, brindan nuevas oportunidades extraordinarias para modelar enfermedades humanas y pueden servir como plataformas para la detección y validación de fármacos. Especialmente con las metodologías cada vez mejores, efectivas y seguras para producir células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas genéticamente idénticas, se generará un número cada vez mayor de iPSC específicas para cada paciente, lo que facilitará enormemente el proceso de modelado de enfermedades. Además, dado el avance de la genética humana en la definición de mutaciones genéticas humanas para diversos trastornos, es posible que se pueda comenzar rápidamente con el descubrimiento de mutaciones genéticas relacionadas con enfermedades para producir iPSC específicas de cada paciente, que luego se pueden diferenciar en el tipo de célula correcto. modelar la enfermedad in vitro, seguido del establecimiento de paradigmas de detección de fármacos utilizando células altamente relevantes para dicha enfermedad. En el contexto de los trastornos neurológicos, tanto la transmisión sináptica como la expresión génica se pueden combinar para la detección de fenotipado y de reversión fenotípica y para la validación de la reversión funcional (transmisión sináptica) in vitro. El vacío que falta para comenzar con la mutación genética y allanar el camino hacia el descubrimiento y desarrollo de fármacos son los estudios preclínicos relacionados con la validación in vivo. Para llenar este vacío, en esta aplicación proponemos utilizar el síndrome de Rett como prueba de principio, para establecer el paradigma de xenoinjerto de células humanas y realizar optogenética y registro in vivo o resonancia magnética funcional (fMRI), para estudiar las características de neurotransmisión/conectividad. de neuronas humanas normales y enfermas. Nuestro enfoque será aplicable a muchos otros modelos de enfermedades neurológicas humanas y permitirá una combinación de farmacocinética y toxicología in vivo junto con los estudios de reversión fenotípica de enfermedades in vivo, cerrando la brecha entre el modelado de enfermedades basado en cultivos celulares y la detección de fármacos para Validación vivo de fármacos candidatos para completar el ciclo de estudios preclínicos, allanando el camino hacia los ensayos clínicos. El éxito de este estudio propuesto tendrá enormes implicaciones para completar el camino del uso de células madre pluripotentes humanas para construir paradigmas novedosos para un proceso completo de desarrollo de fármacos.
Declaración de beneficio para California:
El síndrome de Rett (RTT) es un trastorno progresivo del desarrollo neurológico causado principalmente por mutaciones de pérdida de función en el gen MeCP2 ligado al cromosoma X. Afecta principalmente a mujeres con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 10,000 nacimientos. Después de hasta 18 meses de desarrollo aparentemente normal, los niños con RTT desarrollan síntomas neurológicos graves que incluyen defectos motores, retraso mental, rasgos autistas, convulsiones y ansiedad. RTT es uno de los trastornos del espectro autista (TEA) que afecta a muchos niños en California. En esta aplicación, proponemos utilizar nuestro modelo de síndrome de Rett (RTT) basado en hESC como caso de prueba de principio para definir un conjunto de transcriptomas centrales que pueden usarse para la detección de drogas. Las células madre embrionarias humanas (hESC) tienen un gran potencial para la terapia de reemplazo celular cuando las células se pierden debido a una enfermedad o lesión. Para las enfermedades del sistema nervioso central, las neuronas derivadas de hESC podrían usarse para su reparación. Este enfoque requiere una caracterización cuidadosa de las hESC antes de utilizar sus potenciales terapéuticos. Desafortunadamente, la mayor parte de la caracterización de hESC se realiza in vitro cuando se generan modelos de enfermedad utilizando neuronas derivadas de hESC. En esta aplicación, utilizando RTT como estudio de prueba de principio, cerraremos la brecha y realizaremos una caracterización in vivo de neuronas humanas RTT y normales trasplantadas. Nuestros hallazgos no solo beneficiarán a RTT y a otros pacientes con TEA, sino que también permitirán amplias aplicaciones de este enfoque en el descubrimiento de fármacos utilizando modelos de enfermedades basadas en células madre pluripotentes humanas para beneficiar a los ciudadanos de California en un espectro más amplio.
