Terapia con células madre para la distrofia muscular de Duchenne

El objetivo de este proyecto es desarrollar un nuevo enfoque para la terapia de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En nuestra estrategia, utilizamos células de la piel de pacientes como material de partida y las convertimos en células madre añadiendo genes de "reprogramación". Luego agregamos el gen terapéutico de la distrofina a las células madre para corregir la mutación que causa la DMD. Las células madre corregidas se cultivan de manera que se conviertan en células precursoras musculares. Este proceso se llama diferenciación. Las células precursoras del músculo diferenciadas se inyectan en los músculos enfermos para restaurar las fibras musculares sanas. El objetivo general del proyecto es demostrar toda la estrategia en un modelo de DMD en ratón, utilizando células humanas y de ratón. Los hitos del primer año del proyecto fueron 1A) demostrar la estrategia completa para producir células madre a partir del modelo de ratón y agregar un gen de distrofina correcto en una ubicación precisa de los cromosomas, y 1B) demostrar la diferenciación del tallo humano y del ratón. células en células precursoras musculares que luego se utilizarán para el injerto. Logramos ambos hitos. Hito 1A. Nuestro proyecto aprovecha el reciente descubrimiento de que las células ordinarias de la piel pueden "reprogramarse" en células madre que son similares en sus propiedades a las células embrionarias. El proceso de reprogramación se lleva a cabo mediante la introducción de cuatro genes en las células de la piel que pueden cambiar el patrón de expresión de los genes en las células al de las células embrionarias. Los genes de reprogramación suelen introducirse en las células introduciéndolas en virus que pueden incorporarse o integrarse en los cromosomas. Este proceso es eficaz, pero deja virus incrustados en los cromosomas, que pueden activar genes que causan cáncer. Mi laboratorio ha desarrollado un método de reprogramación más seguro, en el que no se utilizan virus. En lugar de ello, utilizamos una enzima que puede colocar una única copia de los genes de reprogramación en un lugar seguro de los cromosomas. En nuestro método, los genes de reprogramación están presentes en pequeños círculos de ADN que se obtienen fácilmente a partir de bacterias cultivadas en el laboratorio. Los círculos de ADN, junto con el ADN que codifica la enzima de integración, se introducen en las células de la piel del paciente. La enzima hace que los genes de reprogramación se incorporen a un cromosoma en una ubicación única y segura. Una vez reprogramadas las células, los genes de reprogramación que ya no son necesarios se eliminan exactamente de los cromosomas mediante otra enzima. Estas células parecen ser seguras de usar en la clínica. Además, desarrollamos un método para agregar el gen terapéutico de la distrofina a las células reprogramadas en una ubicación precisa. Al agregar una copia correcta del gen de la distrofina, las células madre ahora tienen el potencial de producir músculo sano. Estas células madre corregidas se utilizaron para crear células precursoras musculares en el Hito 1B. Hito 1B. En estos experimentos, demostramos que las células reprogramadas y corregidas por nuestros métodos pueden crecer de tal manera que se diferencien en células precursoras musculares que tienen la capacidad de convertirse en fibras musculares sanas. Este proceso de diferenciación se lleva a cabo durante un período de aproximadamente dos a tres semanas, mientras las células madre se cultivan en placas de plástico en una incubadora. Las células se cultivan en un medio de cultivo que contiene sustancias que permiten que las células se diferencien de las células madre generalizadas a células comprometidas a producir músculo. Seguimos dos procedimientos publicados en la literatura para la diferenciación de las células. Analizamos las células en diferentes momentos para ver si tenían las características de las células precursoras musculares. Primero, observamos las células bajo el microscopio y vimos que se fusionaban formando fibras largas, lo cual es característico de las células musculares. Además, las fibras comenzaron a contraerse y contraerse, lo cual es típico de las fibras musculares. Para analizar las células a nivel molecular, las teñimos con anticuerpos que reconocen proteínas que se producen en las células precursoras del músculo. Pudimos detectar tinciones en algunas de las células del cultivo, lo que indica que se estaban convirtiendo en células precursoras del músculo. Esto se demostró tanto con células madre humanas como de ratón. Para medir qué fracción de células se habían convertido en precursoras musculares, mezclamos el cultivo que contenía células madre de ratón diferenciadas con un anticuerpo que se une a la superficie de las células precursoras musculares. Las células se analizaron con un instrumento que puede medir cuántas células del cultivo se unen al anticuerpo. Descubrimos que entre el 5 y el 10% de las células se tiñeron con el anticuerpo. Este resultado indicó que una fracción significativa de las células se había convertido en células precursoras del músculo, con potencial para ser injertadas. El próximo año, estas células madre de ratón diferenciadas y corregidas se introducirán en ratones DMD para reparar el daño muscular. También aplicaremos nuestros métodos de reprogramación y corrección a células humanas de pacientes con DMD.

El objetivo de este proyecto es desarrollar un nuevo enfoque para la terapia de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En nuestra estrategia, utilizamos células de la piel de pacientes como material de partida y las convertimos en células madre añadiendo genes de "reprogramación". Luego agregamos el gen terapéutico de la distrofina a las células madre para corregir la mutación que causa la DMD. Las células madre corregidas se cultivan de manera que se conviertan en células precursoras musculares. Este proceso se llama diferenciación. Las células precursoras del músculo diferenciadas se inyectan en los músculos enfermos para restaurar las fibras musculares sanas. El objetivo general del proyecto es demostrar toda la estrategia en un modelo de DMD en ratón, utilizando células de ratón y humanas como material de partida. Los primeros hitos del proyecto fueron 1A) demostrar la estrategia completa para producir células madre a partir del modelo de ratón y agregar un gen de distrofina correcto en una ubicación precisa de los cromosomas, y hacer lo mismo con las células humanas (2B). Nuestro proyecto aprovechó el reciente descubrimiento de que las células ordinarias de la piel pueden "reprogramarse" en células madre que son similares en sus propiedades a las células embrionarias. El proceso de reprogramación se lleva a cabo mediante la introducción de cuatro genes en las células de la piel que pueden cambiar el patrón de expresión de los genes en las células al de las células embrionarias. Los genes de reprogramación suelen introducirse en las células introduciéndolas en virus que pueden incorporarse o integrarse en los cromosomas. Este proceso es eficaz, pero deja virus incrustados en los cromosomas, que pueden activar genes que causan cáncer. Nuestro laboratorio desarrolló un método más seguro para la reprogramación, en el que no se utilizan virus. En lugar de ello, utilizamos una enzima que puede colocar una única copia de los genes de reprogramación en un lugar seguro de los cromosomas. En nuestro método, los genes de reprogramación están presentes en pequeños círculos de ADN que se obtienen fácilmente a partir de bacterias cultivadas en el laboratorio. Los círculos de ADN, junto con el ADN que codifica la enzima de integración, se introducen en las células de la piel. La enzima hace que los genes de reprogramación se incorporen a un cromosoma en una ubicación única y segura. Una vez reprogramadas las células, los genes de reprogramación que ya no son necesarios se eliminan exactamente de los cromosomas mediante otra enzima. Además, desarrollamos un método para agregar el gen terapéutico de la distrofina a las células reprogramadas en una ubicación precisa. Al agregar una copia correcta del gen de la distrofina, las células madre ahora tienen el potencial de producir músculo sano. Estas células madre corregidas se utilizaron para crear células precursoras musculares en el Hito 1B. En los experimentos de Milestone 1B, demostramos que las células reprogramadas y corregidas mediante nuestros métodos pueden crecer de tal manera que se diferencien en células precursoras musculares que tienen la capacidad de convertirse en fibras musculares sanas. Este proceso de diferenciación se lleva a cabo durante un período de varias semanas, mientras las células madre se cultivan en placas de plástico en una incubadora. Las células se cultivan en fluidos de cultivo que contienen sustancias que permiten que las células se diferencien de las células madre generalizadas a células comprometidas a producir músculo. Analizamos las células en diferentes momentos para ver si tenían las características de las células precursoras musculares. Observamos las células bajo el microscopio y vimos que se fusionaban formando fibras largas, lo cual es característico de las células musculares. Además, las fibras comenzaron a contraerse y contraerse, lo cual es típico de las fibras musculares. Para analizar las células a nivel molecular, las teñimos con anticuerpos que reconocen proteínas que se producen en las células precursoras del músculo y también demostramos que contenían ARN mensajero que codificaba proteínas musculares. También verificamos que las células expresaban el gen de distrofina que insertamos en ellas y producían proteína distrofina normal. Para medir qué fracción de células se habían convertido en precursoras musculares, mezclamos el cultivo que contenía células madre de ratón diferenciadas con un anticuerpo que se une a la superficie de las células precursoras musculares. Las células se analizaron con un instrumento que puede medir cuántas células del cultivo se unen al anticuerpo. Encontramos que entre el 20 y el 50% de las células se tiñeron con el anticuerpo. Este resultado indicó que una fracción significativa de las células se había convertido en células precursoras del músculo, con potencial para ser injertadas. En Milestone 2A, introdujimos estas células madre de ratón diferenciadas y corregidas en ratones modelo DMD para reparar el daño muscular. Inyectamos las células en el músculo de una pierna y, tres semanas después, detectamos células injertadas mediante tinción para detectar distrofina. El año que viene realizaremos los experimentos finales, Milestone 3, en los que células humanas que han sido reprogramadas y corregidas se injertarán en ratones modelo de la enfermedad.

Este proyecto ha supuesto un gran avance en el desarrollo de una terapia con células madre para la distrofia muscular de Duchenne. Durante el período del proyecto, pasamos de una estrategia conceptual a hacer que todas las partes de la estrategia funcionaran, mientras al mismo tiempo descubrimos mejoras en todos los aspectos. Los estudios comenzaron con el desarrollo de una forma nueva y potencialmente más segura de reprogramar células de ratón. Comenzamos con células de la piel de ratones modelo con la enfermedad mdx e introdujimos un plásmido, o círculo de ADN, que codificaba cuatro genes que podían reprogramar las células de la piel para convertirlas en células de tipo embrionario. Usamos una enzima de una bacteria llamada "recombinasa" para pegar los genes de reprogramación en un lugar seguro de los cromosomas del ratón. El siguiente paso fue utilizar una segunda enzima recombinasa para colocar una copia correcta del gen de la distrofina, el gen que está mutado en esta forma de distrofia muscular, en una posición precisa junto a los genes de reprogramación. Una vez logrado esto, utilizamos una tercera recombinasa para eliminar las porciones de ADN insertado que ya no eran necesarias, incluidos los genes de reprogramación. Estos pasos nos dejaron con “células madre pluripotentes inducidas”, o iPSC, que fueron corregidas para detectar la mutación que causa la enfermedad. En el siguiente paso, utilizamos métodos para hacer crecer las iPSC que las indujeron a convertirse en células precursoras musculares. Medimos estos cambios monitoreando varias proteínas que son típicas de las células musculares. Estas proteínas musculares comenzaron a aparecer en las iPSC a medida que atravesaban el proceso de diferenciación. Una vez que las células se diferenciaron, las inyectamos en los músculos de las piernas de ratones vivos que padecían distrofia muscular. Demostramos que las células que inyectamos podían injertarse en el músculo, donde podían reparar y reemplazar las fibras musculares dañadas. Después de haber llevado a cabo con éxito la estrategia completa con células madre utilizando células de ratón, publicamos nuestros hallazgos en una revista científica y buscamos desarrollar una estrategia similar utilizando células humanas. Descubrimos que la estrategia de reprogramación que habíamos utilizado en células de ratón no funcionaba bien en células humanas. Por lo tanto, recurrimos a un método de reprogramación que dos laboratorios informaron recientemente, en el que se utilizan plásmidos basados ​​en el virus de Epstein-Barr para transportar los genes de reprogramación a las células humanas. Los plásmidos de larga duración proporcionaron una dosis suficiente de genes de reprogramación, de modo que las células humanas se convirtieron en iPSC. Para proporcionar una copia correcta del gen mutado, desarrollamos un nuevo método de ingeniería genómica llamado DICE, para el intercambio de casetes de integrasa dual. En este método, se colocó una secuencia corta de ADN llamada "plataforma de aterrizaje" en un lugar especial de los cromosomas llamado H11. Esta ubicación tiene características que la hacen favorable como lugar para colocar genes introducidos. La plataforma de aterrizaje contiene secuencias de reconocimiento para dos enzimas recombinasas diferentes. Cuando un trozo de ADN que contiene los genes que queremos insertar está flanqueado por secuencias de reconocimiento de las dos enzimas, la plataforma de aterrizaje es reemplazada por el gen que queremos insertar. Al utilizar este método, generamos iPSC que tenía un nuevo gen insertado precisamente en la ubicación H11. El siguiente paso es diferenciar las células en células precursoras musculares. El procedimiento que había funcionado en células de ratón no fue eficaz en células humanas. Probamos dos métodos nuevos y ambos generaron células precursoras de músculos humanos con buena eficiencia. Trasplantamos las células precursoras del músculo diferenciadas en los músculos de las piernas de ratones inmunodeficientes. Los ratones necesitaban ser inmunodeficientes para poder aceptar injertos de células humanas sin rechazarlas. Obtuvimos evidencia de que las células humanas se injertaron con éxito en el músculo. Hasta ahora, introducíamos las células madre inyectándolas directamente en un músculo con una aguja. Este procedimiento funciona bien en los músculos pequeños de un ratón, pero no funcionaría bien en los músculos mucho más grandes de un ser humano. Por lo tanto, también comenzamos a desarrollar un nuevo método de administración de células madre en el que las células madre se introducen en una arteria, donde pueden acceder al tejido muscular pasando a través de la pared del vaso sanguíneo hasta el tejido muscular. Generamos resultados preliminares que sugieren que este sistema de administración arterial podría ser un medio exitoso para distribuir células madre sanas a los músculos enfermos de todo el cuerpo. Tenemos la intención de seguir desarrollando esta estrategia de células madre para que pueda utilizarse para ayudar a reparar los músculos en pacientes con distrofia muscular.