La matriz de células madre: un mapa de las vías moleculares que definen las células pluripotentes

En nuestra solicitud de subvención para Herramientas y Tecnologías propusimos eliminar un obstáculo importante en el desarrollo de terapias con células madre: la falta de herramientas confiables para la identificación de células madre humanas y células diferenciadas de estas células madre. En el último año hemos logrado avances considerables hacia este objetivo y hemos cumplido todos los hitos propuestos. De hecho, superamos ampliamente nuestros objetivos, generando y analizando muchos más datos de los que habíamos propuesto. Nuestro éxito fue posible gracias a los siguientes factores: 1. Se instaló en nuestro laboratorio un novedoso instrumento de análisis (Illumina BeadStation) adquirido con fondos CIRM. 2. Un personal altamente calificado y métodos rigurosos de control de calidad llevaron a la generación de datos de una calidad consistentemente superior a la esperada según la experiencia de otros investigadores. 3. Realizamos mejoras en los métodos de análisis de datos, lo que permitió analizar los datos más rápidamente. 4. Las mejoras en la confiabilidad de la reprogramación de líneas iPSC y la generación de líneas hESC significaron que obtuvimos más líneas de alta calidad para el análisis de lo que esperábamos. 5. Hubo un nivel inesperadamente alto de interés en la colaboración, lo que llevó a la adición de muestras que se analizaron utilizando otros mecanismos de financiación. 6. Hemos creado herramientas web mejoradas para que el acceso sea más eficiente y fácil de usar. Hasta ahora, realizamos más de 2000 pruebas de más de 250 muestras de células madre diferenciadas y no diferenciadas. Decidimos desarrollar nuestra propia plataforma de acceso a bases de datos que permitiría que otros investigadores de todo el mundo utilizaran nuestros datos para realizar pruebas simplificadas de nuevas líneas de células madre. En nuestro punto de referencia actual, basado en la recopilación de datos Stem Cell Matrix-2 financiada por CIRM, podemos predecir la pluripotencia en cultivos celulares con >99% de especificidad y >99% de sensibilidad, utilizando datos de un solo microarray de $80.

Actualmente, CIRM apoya la generación de cientos de líneas iPSC y ESC humanas para investigación básica, investigación traslacional y tratamientos de enfermedades. En el pasado, la única manera de demostrar que estas líneas celulares son pluripotentes (una necesidad para las publicaciones revisadas por pares) era trasplantar aproximadamente un millón de células al músculo, riñón u otro sitio en un ratón inmunodeficiente. Uno o dos meses después, si las células son pluripotentes, se convertirán en un tumor grande llamado teratoma. El teratoma contiene tejidos reconocibles como cartílago, tejido glandular y células nerviosas; si se identifica una diversidad suficiente de tipos de células en el tumor, se dice que la línea celular es pluripotente. La técnica del teratoma es difícil de aprender, poco fiable y utiliza animales de laboratorio; un investigador lo llamó “el ensayo más ridículo del planeta”, y la mayoría de los investigadores de células madre preferirían un tipo diferente de ensayo para determinar la pluripotencia de las células madre humanas. Este premio de Herramientas y Tecnologías propuso desarrollar nuevos métodos para determinar si las células madre humanas son pluripotentes o no mediante el análisis de las actividades de sus genomas. Sabemos desde hace varios años que el perfil de expresión genética (cuáles de los 25,000 genes están activos) de las células madre pluripotentes humanas (hESC e iPSC) es muy diferente de cualquier otro tipo de célula. Publicamos esta información en 2008 en la revista científica Nature. Para el ensayo de pluripotencia, que llamamos "PluriTest", recopilamos perfiles de expresión genética de más de 400 muestras de células humanas pluripotentes normales y desarrollamos un nuevo algoritmo informático para utilizar la información de expresión genética para identificar las características típicas de la pluripotencia. Las células pluripotentes pueden tener una variedad de perfiles de expresión genética diferentes, pero existe una superposición entre ellas en cuanto a cuáles genes están activados y cuáles desactivados. PluriTest captura estas variaciones, lo que facilita a los investigadores confirmar la pluripotencia de sus células comparando el perfil de expresión genética de sus células con el perfil típico generado por PluriTest. Este enfoque es el mismo que adoptan los investigadores que desarrollan ensayos de diagnóstico para el cáncer; Las pruebas de “diagnóstico molecular” son extremadamente valiosas para determinar las características de un cáncer y cómo debe tratarse. La prueba de diagnóstico molecular PluriTest es extremadamente precisa y sensible para determinar si una línea celular es pluripotente o no. Una vez que se obtiene el perfil de expresión genética de una línea celular, a un costo de entre 150 y 300 dólares, los datos se cargan en el sitio web de PluriTest y, diez minutos después, el usuario obtiene tanto una “puntuación de pluripotencia” como una “puntuación de novedad”. para su línea celular. Si la puntuación de pluripotencia es alta, las células son definitivamente pluripotentes; Si se realizara un ensayo de teratoma en las células, siempre sería positivo. Sin embargo, una línea celular puede tener tanto una puntuación alta de pluripotencia como una puntuación alta de novedad; este es el caso de las líneas celulares aneuploides (células con cromosomas duplicados o faltantes) y tumores similares a células madre embrionarias. PluriTest puede identificar células que no están completamente reprogramadas en técnicas iPSC ("células parcialmente reprogramadas") y puede usarse para rastrear el progreso de los protocolos de diferenciación. Cuando las células se diferencian, se mueven lentamente desde el “espacio pluripotente, no nuevo” al “espacio no pluripotente, altamente novedoso”. Planeamos utilizar este enfoque para desarrollar pruebas de diagnóstico molecular para la diferenciación; estamos trabajando en un “CardioTest”, un “NeuroTest” y un “HepatoTest”, utilizando el mismo enfoque de recolectar grandes cantidades de muestras para que podamos identificar con precisión el variaciones comunes entre tipos de células específicas. PluriTest ha tenido gran aceptación en la comunidad de investigación de células madre: en los 3 meses transcurridos desde que se publicó el artículo (en Nature Methods), se han cargado más de 1500 perfiles de expresión genética en nuestro sitio web y han sido analizados por PluriTest.