Integración específica del sitio de Lmx1a, FoxA2 y Otx2 para optimizar la diferenciación dopaminérgica

Las neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central de los mamíferos. Su pérdida está asociada con un importante trastorno neurológico humano, la enfermedad de Parkinson (EP). No existe cura para la EP ni tampoco existen buenas terapias a largo plazo sin efectos secundarios nocivos. Por tanto, existe una gran necesidad de nuevas terapias para detener o revertir la enfermedad. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva tecnología para obtener una población más pura y abundante de neuronas DA del mesencéfalo en una placa de cultivo. Estas células serían útiles para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el desarrollo de terapias celulares. Descubrimientos recientes nos permiten utilizar células de piel humana adulta, introducirles genes específicos y generar células, denominadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que exhiben las características de las células madre embrionarias. Estas iPSC, cuando se derivan de células de la piel de pacientes con EP, se pueden utilizar como modelo experimental para estudiar los mecanismos de la enfermedad que son exclusivos de la EP. Cuando se diferencian en neuronas DA, estas células en realidad se ven afectadas patológicamente por la EP. Los métodos actuales para la diferenciación neuronal DA dirigida a partir de iPSC son inadecuados en términos de eficiencia y reproducibilidad. Esta situación dificulta la capacidad de establecer un modelo sólido para la neurodegeneración relacionada con la EP. En este estudio, utilizamos una tecnología de integración genética nueva y eficiente para inducir la expresión de genes específicos del mesencéfalo en líneas de iPSC derivadas de un paciente con EP y un hermano normal. La expresión forzada de estos genes del factor de transcripción del mesencéfalo hace que las iPSC se diferencien en neuronas DA en cultivos celulares. Una población más pura de neuronas DA del mesencéfalo puede sentar las bases para modelar con éxito la EP y mejorar las tasas de acierto en los enfoques de detección de drogas. Los hitos del primer año del proyecto fueron establecer líneas iPSC específicas de la EP que contengan sitios de "acoplamiento" genómicos, denominados sitios "attP". En el año 2, estas líneas celulares iPSC/attP se utilizarán para insertar factores de transcripción específicos del mesencéfalo con alta eficiencia, mediados por enzimas llamadas integrasas. Anteriormente establecimos una tecnología de integración de ADN específica de sitio, mejorada y de alta eficiencia en ratones. Esta tecnología combina el sistema de integrasa con ubicaciones recientemente identificadas y expresadas activamente en el genoma y garantiza una expresión genética eficiente y uniforme. Las líneas iPSC específicas de pacientes con EP que utilizamos fueron PI-1754, que contiene una mutación grave en el gen SNCA (sinucleína alfa), y una línea hermana no afectada, PI-1761. La mutación SNCA causa síntomas clínicos dramáticos de la EP, con una enfermedad progresiva de aparición temprana. Utilizamos un procedimiento basado en recombinación homóloga para colocar el sitio de "acoplamiento", attP, en ubicaciones bien expresadas en SNCA y controlar las líneas iPSC (Objetivo 1.1). También incluimos una línea de células madre embrionarias humanas, H9, para monitorear nuestros procedimientos experimentales. Las ubicaciones genómicas que elegimos para la ubicación de los sitios attP incluyeron un sitio en el cromosoma 22 (Chr22) y un segundo sitio de respaldo en el cromosoma 19 (Chr19). Estos dos sitios se eligieron basándose en estudios con ratones, en los que los equivalentes en ratones de ambas ubicaciones conferían una fuerte expresión genética. Para realizar la recombinación, construimos vectores de direccionamiento, cada uno de los cuales contiene un casete attP flanqueado por fragmentos homólogos 5' y 3' correspondientes a la ubicación genómica humana a la que queremos dirigirnos. Para el locus Chr22, pudimos obtener las 3 construcciones dirigidas para las líneas celulares PI-1754, PI-1761 y H9. Por razones técnicas, no pudimos obtener construcciones para la ubicación de Chr19. Por lo tanto, decidimos centrarnos en el lugar de Chr22 y pasar al siguiente paso. Introdujimos los vectores de direccionamiento en las células y seleccionamos clones positivos mediante la selección de fármacos y la expresión de la proteína fluorescente verde. Para las células H9, obtuvimos 110 clones doblemente positivos y analizamos 98 de ellos. Encontramos 8 clones que habían dirigido el sitio attP precisamente al locus Chr22. Para la línea de control hermana PI-1761, obtuvimos 44 clones, y 1 de ellos tenía el sitio attP insertado en el locus Chr22. La línea mutante PI-1754 SNCA, por otro lado, crece lentamente en cultivo celular. Estamos en el proceso de obtener suficientes células para realizar el experimento de recombinación en esa línea celular. En resumen, demostramos que la estrategia experimental propuesta en la subvención realmente funcionó. Tuvimos éxito en la obtención de líneas iPSC con un sitio de "acoplamiento" colocado en una ubicación genómica humana preseleccionada. Estas líneas celulares son los materiales necesarios que preparan el escenario para que cumplamos los hitos del año 2.

La enfermedad de Parkinson (EP) es causada por la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en el mesencéfalo. Estas neuronas DA son la principal fuente de dopamina, una sustancia química importante en el sistema nervioso central. La EP es un trastorno neurológico común que afecta al 1% de las personas de 60 años y al 4% de las mayores de 80. Desafortunadamente, no existe cura para la EP ni existe ninguna terapia a largo plazo sin efectos secundarios dañinos. Por tanto, se necesitan nuevas terapias para detener o revertir la enfermedad. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva tecnología que nos ayude a obtener una población de neuronas DA más pura y abundante en una placa de cultivo y caracterizar las células resultantes. Estas células serán útiles para estudiar la enfermedad, detectar posibles fármacos y desarrollar terapias celulares. Gracias a descubrimientos recientes, podemos introducir genes específicos en células de la piel humana adulta y generar células similares a las células madre embrionarias, denominadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Estas iPSC, cuando se derivan de pacientes con EP, se pueden utilizar como modelo experimental para estudiar los mecanismos de la enfermedad que son exclusivos de la EP, porque cuando se diferencian en neuronas DA, estas células en realidad se ven afectadas patológicamente por la EP. Estamos utilizando una línea PD iPSC llamada PI-1754 derivada de un paciente con una mutación grave en el gen SNCA, que codifica la alfa-sinucleína. La mutación SNCA causa síntomas clínicos dramáticos de la EP, con una enfermedad progresiva de aparición temprana. A modo de comparación, utilizamos una línea iPSC PI-1761 hermana normal y no afectada. También estamos utilizando una línea H9 de células madre embrionarias humanas normales (ESC) como estándar de oro para la diferenciación. Los métodos actuales para diferenciar iPSC en neuronas DA no son adecuados en términos de eficiencia y confiabilidad. Nuestra hipótesis es que la expresión forzada de ciertos genes específicos del mesencéfalo llamados factores de transcripción hará que las iPSC se diferencien más eficazmente en neuronas DA en cultivos celulares. Usamos factores de transcripción llamados Lmx1a, Otx2 y FoxA2, ​​abreviados L, O y F. En este proyecto, hemos desarrollado una nueva y eficiente tecnología de integración de genes que nos permite introducir y expresar rápidamente estos genes de factores de transcripción en varias combinaciones, para probar si estimulan la diferenciación de iPSC en neuronas DA. En el primer año del proyecto, comenzamos a establecer líneas iPSC y ESC que contenían un sitio de “plataforma de aterrizaje” genómico para la inserción de genes de factores de transcripción. Elegimos cuidadosamente una ubicación para la colocación de los genes basándonos en trabajos previos en ratones que sugerían que un sitio en el cromosoma 22 humano proporcionaría una expresión genética fuerte y constante. Inicialmente utilizamos recombinación homóloga ordinaria para colocar la plataforma de aterrizaje en este sitio. Al final del año 1 del proyecto, este método tuvo éxito en las iPSC normales y en las ESC, pero no en las iPSC PD, más difíciles de cultivar. Para resolver este problema, en el año 2 introdujimos una tecnología de recombinación nueva y más poderosa, llamada TALEN, y logramos colocar la plataforma de aterrizaje en la posición correcta en las tres líneas, incluido el PD iPSC. Ahora estábamos en condiciones de insertar genes de factores de transcripción específicos del mesencéfalo con gran eficacia. Para este paso, desarrollamos una nueva metodología de ingeniería genómica llamada DICE, para el intercambio de casetes de integrasa dual. En esta tecnología, utilizamos dos enzimas integrasas específicas de sitio, llamadas phiC31 y Bxb1, para catalizar la ubicación precisa de los genes del factor de transcripción en el lugar deseado del genoma. Construimos casetes de genes que contienen todas las combinaciones por pares de los factores de transcripción L, O y F, LO, LF y OF, y la combinación triple, LOF. Demostramos con éxito el poder de esta tecnología generando rápidamente un gran conjunto de iPSC y ESC que contenían todas las combinaciones anteriores de factores de transcripción, así como líneas que no contenían factores de transcripción, como controles negativos para comparación. Se eligieron dos ejemplos de cada tipo de línea para el iPSC 1754 y 1761 y el ESC H9 para estudios de diferenciación y caracterización funcional. Los resultados iniciales de estos estudios han demostrado la correcta diferenciación de las células madre neurales y la expresión de los genes del factor de transcripción introducidos. En resumen, logramos obtener líneas ESC e iPSC de células normales y de pacientes con EP que llevan una plataforma de aterrizaje en una ubicación genómica preseleccionada, elegida y validada para una fuerte expresión genética. Estas líneas son reactivos valiosos. Luego modificamos estas líneas para agregar factores de transcripción asociados a DA en cuatro combinaciones. Todas estas líneas se encuentran actualmente en estudios de diferenciación de acuerdo con los cronogramas del segundo y tercer año. Durante el tercer año del proyecto, se establecerá la correlación entre la expresión de varios factores de transcripción y el nivel de diferenciación de DA. Además se realizarán estudios funcionales con la PD versus líneas normales.

El objetivo de este proyecto es desarrollar enfoques y tecnologías que mejoren la diferenciación neuronal de las células madre en neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo. Las neuronas DA son de importancia central en el proyecto, porque son las células que están dañadas en pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). Los métodos de diferenciación actuales suelen producir bajos rendimientos de neuronas DA. Los métodos también dan resultados variables y las poblaciones celulares contienen muchos tipos de células. Estos impedimentos han obstaculizado el estudio de los mecanismos de la enfermedad de EP, así como otros usos de las células, como la detección de fármacos y la terapia de reemplazo celular. Nuestra estrategia es desarrollar un método novedoso para introducir genes en el genoma en un lugar específico, de modo que podamos agregar rápidamente genes que podrían ayudar en la diferenciación de las neuronas DA. Los genes que nos gustaría agregar se llaman factores de transcripción, que son proteínas involucradas en la diferenciación de las células madre en neuronas DA. Hemos colocado los genes de tres factores de transcripción en una posición activa y segura en el cromosoma 22 humano en las líneas celulares que estamos estudiando. Estas células, llamadas células madre pluripotentes, tienen el potencial de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula. En nuestro estudio utilizamos células madre embrionarias, así como células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que son similares, pero se derivan de células adultas, en lugar de un embrión. Estamos utilizando iPSC derivadas de un paciente con EP, así como iPSC de una persona normal, para comparar. Mediante la expresión forzada de estos factores de transcripción neuronal, podemos lograr una generación más eficiente y reproducible de neuronas DA. Los efectos de la expresión de diferentes combinaciones de los tres factores de transcripción llamados Lmx1a, FoxA2 y Otx2 sobre la diferenciación neuronal DA se evaluarán en el contexto de células madre embrionarias (ESC) como estándar de oro, así como en iPSC derivadas de un paciente con EP. con una mutación grave en alfa-sinucleína e iPSC derivada de un control normal. Los ensayos funcionales comparativos de las neuronas DA resultantes completarán el análisis. Hasta la fecha, este proyecto ha creado una tecnología novedosa para modificar el genoma. La estrategia se desarrolló a partir de la que propusimos originalmente, pero contiene varias innovaciones que la hacen más poderosa y útil. La nueva metodología, llamada DICE para Dual Integrase Cassette Exchange, nos permitió generar líneas celulares "maestras" o receptoras para ESC, iPSC normal y PD iPSC. Estas líneas celulares receptoras contienen una "plataforma de aterrizaje" colocada en una ubicación recientemente identificada y expresada activamente en el cromosoma humano 22 llamada H11 que permite una expresión robusta de los genes colocados en ella. Luego generamos una serie de líneas celulares mediante "intercambio de casetes" en el locus H11. En el intercambio de casetes, los nuevos genes que queremos agregar ocupan el lugar de la plataforma de aterrizaje que colocamos originalmente en las células. El intercambio de casetes es una buena forma de introducir varios genes en el mismo lugar de los cromosomas. Creamos líneas celulares que expresan tres factores de transcripción neuronal que se sospecha están involucrados en la diferenciación neuronal de DA, en todas las combinaciones por pares, incluidas líneas con expresión de los tres factores y líneas de control negativo sin factores de transcripción agregados. Esta colección de líneas de células madre pluripotentes humanas modificadas se está utilizando ahora para estudiar la diferenciación neuronal. Las ESC modificadas se han diferenciado en neuronas DA y se están evaluando los efectos de las diferentes combinaciones de factores de transcripción en la diferenciación neuronal DA. Durante el último año del proyecto, se completará este análisis de diferenciación y también analizaremos las propiedades funcionales de las neuronas DA diferenciadas, con especial énfasis en las características relacionadas con la enfermedad de las células derivadas de iPSC de PD.

El objetivo de este proyecto es desarrollar tecnologías y enfoques que mejoren la diferenciación de células madre en neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo. Las neuronas DA tienen una importancia central en el proyecto, porque son las células dañadas en los pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). Parece que las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo tienen una enorme necesidad de energía, lo que podría ayudar a explicar su vulnerabilidad a la degeneración en la EP. Los métodos de diferenciación actuales suelen producir bajos rendimientos de neuronas DA. Los métodos también dan resultados variables y las poblaciones celulares contienen muchos tipos de células. Estos impedimentos han obstaculizado el estudio de los mecanismos de la enfermedad de EP, así como otros usos de las células, como la detección de fármacos y la terapia de reemplazo celular. Nuestra estrategia es desarrollar un método novedoso para introducir genes en el genoma en un lugar específico, de modo que podamos agregar rápidamente genes que podrían ayudar en la diferenciación de las neuronas DA. Los genes que nos gustaría agregar se denominan factores de transcripción, que son proteínas involucradas en la diferenciación de las células madre en neuronas DA. Hemos colocado los genes de tres factores de transcripción en una posición activa y segura en el cromosoma 22 humano en las líneas celulares que estamos estudiando. Estas células, llamadas células madre pluripotentes, tienen la capacidad de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula. En nuestro estudio utilizamos células madre embrionarias, así como células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que son similares, pero se derivan de células adultas, en lugar de un embrión. Estamos utilizando iPSC derivadas de un paciente con EP, así como iPSC de una persona normal, para comparar. Mediante la expresión forzada de factores de transcripción neuronal, podemos lograr una generación más eficiente y reproducible de neuronas DA. Queremos evaluar los efectos de la expresión de diferentes combinaciones de tres factores de transcripción llamados Lmx1a, FoxA2 y Otx2 sobre la diferenciación neuronal DA en el contexto de células madre embrionarias (ESC) como estándar de oro, así como en iPSC derivadas de un paciente con EP. con una mutación grave en alfa-sinucleína y en iPSC derivadas de una persona normal sin EP. Los ensayos funcionales comparativos de las neuronas DA resultantes completarán el análisis. Hasta la fecha, este proyecto ha creado una tecnología novedosa para modificar el genoma. La estrategia se desarrolló a partir de la que propusimos originalmente, pero contiene varias innovaciones que la hacen más poderosa y útil. La nueva metodología, llamada DICE para Dual Integrase Cassette Exchange, nos permitió generar líneas celulares "maestras" o receptoras para ESC, iPSC normal y PD iPSC. Estas líneas celulares receptoras contienen una "plataforma de aterrizaje" colocada en una ubicación recientemente identificada y expresada activamente en el cromosoma humano 22 llamada H11 que permite una expresión robusta de los genes colocados en ella. Luego generamos una serie de líneas celulares mediante "intercambio de casetes" en el locus H11. En el intercambio de casetes, los nuevos genes que queremos agregar ocupan el lugar de la plataforma de aterrizaje que colocamos originalmente en las células. El intercambio de casetes es una buena forma de introducir varios genes en el mismo lugar de los cromosomas. Creamos líneas celulares que expresan tres factores de transcripción neuronal que se sospecha están involucrados en la diferenciación neuronal de DA, en todas las combinaciones por pares, incluidas líneas con expresión de los tres factores y líneas de control negativo sin factores de transcripción agregados. Esta colección de líneas de células madre pluripotentes humanas modificadas se está utilizando para estudiar la diferenciación neuronal. Las ESC modificadas se utilizaron para formar cuerpos embrioides, que son agregaciones esféricas de células madre similares a un embrión que son favorables para producir células diferenciadas. Descubrimos que los cuerpos embrioides experimentaron un rápido proceso de diferenciación espontánea en neuronas DA. La diferenciación se estimuló en las células que expresaban factores de transcripción insertados, y algunas combinaciones de factores de transcripción fueron mejores que otras para provocar la diferenciación neuronal DA. La mejor diferenciación la obtuvimos en las líneas que expresaban los factores de transcripción LMX1A y OTX2. En estudios continuos, analizaremos las propiedades funcionales de las neuronas DA diferenciadas, con especial énfasis en las características relacionadas con la enfermedad de las células derivadas de iPSC de PD.