El objetivo del proyecto es encontrar una nueva forma de convertir células adultas, como las de la piel, en células madre que tengan la capacidad de diferenciarse en muchos tejidos. El método original para hacer esta “reprogramación” utilizaba virus, que pueden hacer que las células sean propensas al cáncer. Estamos desarrollando un nuevo método que no utiliza virus y se espera que sea más seguro. Para iniciar los estudios, construimos varios plásmidos nuevos, o círculos de ADN, que contienen de dos a cuatro genes que pueden estimular que las células adultas se conviertan en células madre. También incluimos una sección de ADN que lleva una señal de "insértame" que hace que el plásmido se integre en los cromosomas de la célula cuando está presente una enzima integrasa. Estos plásmidos tienen el potencial de reprogramar células y los estamos probando para ver cuáles funcionan mejor. El siguiente objetivo era encontrar métodos para introducir eficazmente el ADN plasmídico en las células humanas y de ratón que queríamos reprogramar. Probamos una serie de agentes químicos y también probamos un método que utiliza una descarga eléctrica para alterar la membrana celular. El último método, llamado electroporación, funcionó mejor. Usando estos métodos, verificamos que los genes de reprogramación que colocamos en el plásmido funcionaban. Utilizamos electroporación para introducir un plásmido de reprogramación y un plásmido que porta el gen de la integrasa en las células de la piel y observamos colonias de células que tenían las características de las células madre embrionarias. Debido al gran potencial de poder producir células similares a las células madre embrionarias a partir de células adultas comunes, muchos grupos científicos están trabajando en este campo y han realizado contribuciones novedosas. Por ejemplo, se ha descubierto que ciertos tipos de células adultas son más fáciles de reprogramar que otros y que es posible sustituir algunos de los genes de reprogramación por moléculas pequeñas. Planeamos combinar algunos de estos avances con nuestro enfoque para aumentar la eficiencia de la reprogramación, utilizar menos genes de reprogramación y producir células reprogramadas de mayor calidad. El próximo año llevaremos a cabo ese trabajo, además de caracterizar exhaustivamente las células reprogramadas que producimos, en términos de su capacidad para diferenciarse en diferentes tipos de tejidos y mostrar otras características de las células madre embrionarias. También comenzaremos experimentos para utilizar células reprogramadas obtenidas con estos métodos para curar enfermedades genéticas.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
El objetivo del proyecto es encontrar nuevas formas de convertir células adultas, como las de la piel, en células madre que tengan la capacidad de diferenciarse en muchos tejidos. Los métodos originales para realizar esta “reprogramación” utilizaban virus, que pueden hacer que las células sean propensas al cáncer. Hemos desarrollado nuevos métodos que no utilizan virus y se espera que sean más seguros. Para iniciar los estudios, construimos un nuevo plásmido, o círculo de ADN, que porta cuatro genes que pueden estimular que las células adultas se conviertan en células madre. También incluimos una sección de ADN que lleva una señal de "insértame" que hace que el plásmido se integre en los cromosomas de la célula cuando está presente una enzima integrasa. Para introducir el ADN plasmídico en las células, empleamos un método que utiliza una descarga eléctrica para alterar la membrana celular. Este método, llamado electroporación, se utilizó para introducir el plásmido reprogramador y un plásmido que porta el gen de la integrasa en células humanas y de ratón. Después de cultivar las células durante una a tres semanas, observamos colonias de células que tenían las características de las células madre embrionarias. Probamos que las células reprogramadas eran células madre mediante la realización de muchos ensayos. Por ejemplo, demostramos que las células reprogramadas expresaban genes característicos de las células madre embrionarias y eran diferentes de los genes expresados en las células iniciales. También caracterizamos las células reprogramadas que produjimos en términos de su capacidad para diferenciarse en diferentes tipos de tejidos tanto en cultivo como cuando se inyectaron en ratones. En una prueba muy estricta de reprogramación, demostramos que las células de ratón reprogramadas podían formar muchas partes del cuerpo del ratón cuando se inyectaban en embriones tempranos. Estas pruebas demostraron que habíamos producido células madre reprogramadas de alta calidad mediante nuestro nuevo método. El método terminado contiene tres pasos y se llama estrategia de triple recombinasa porque utiliza tres enzimas de recombinación diferentes para lograr diferentes pasos. Usamos una enzima integrasa para agregar genes de reprogramación en ciertas ubicaciones preferidas del genoma. Una vez realizada la reprogramación, utilizamos una segunda enzima para eliminar con precisión los genes de reprogramación, ya que ya no son necesarios ni deseados. Luego utilizamos una enzima integrasa diferente para insertar un gen terapéutico en la ubicación preferida que anteriormente ocupaban los genes de reprogramación. Esto coloca al gen terapéutico en una posición en el genoma que se expresará fuertemente. Ahora estamos perfeccionando nuestro método para hacerlo aún más fácil, seguro y eficiente para producir células madre humanas reprogramadas. También hemos comenzado experimentos para utilizar las células reprogramadas obtenidas con estos métodos para curar enfermedades genéticas. Por ejemplo, estamos diferenciando las células madre reprogramadas en células precursoras musculares que podrían usarse para formar fibras musculares sanas en pacientes con distrofia muscular de cinturas.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Este proyecto ha desarrollado un nuevo método para producir células madre a partir de células adultas normales, como las células de la piel. Nuestro proyecto utiliza el descubrimiento de que las células cutáneas ordinarias pueden "reprogramarse" en células madre que tienen un potencial similar al de las células madre embrionarias. Estas células pueden convertirse en cualquier tipo de célula y son útiles para comprender y tratar muchas enfermedades. El proceso de reprogramación se realiza mediante la introducción de cuatro genes que pueden cambiar el patrón de expresión de los genes en una célula de la piel al de una célula embrionaria. Los genes de reprogramación generalmente se introducen en las células introduciéndolas en virus que pueden incorporarse o integrarse en los cromosomas. Este proceso es eficaz para provocar la reprogramación, pero deja virus incrustados en los cromosomas, que pueden activar genes que causan cáncer. Para solucionar este problema, mi laboratorio ha desarrollado un método de reprogramación más seguro, en el que no se utilizan virus. En lugar de ello, utilizamos una enzima que puede colocar una única copia de los genes de reprogramación en un lugar seguro de los cromosomas. En nuestro método, los genes de reprogramación están presentes en pequeños círculos de ADN que se elaboran y purifican fácilmente a partir de bacterias cultivadas en el laboratorio. Los círculos de ADN, junto con el ADN que codifica la enzima de integración, se introducen en las células de la piel. La enzima hace que los genes de reprogramación se incorporen a un cromosoma en una ubicación única y segura. Una vez reprogramadas las células de este modo, los genes reprogramadores se eliminan de los cromosomas de forma completa y precisa mediante la introducción de otra enzima. El resultado son células reprogramadas cuyos cromosomas son muy similares a los cromosomas de la célula inicial y no contienen genes de reprogramación añadidos. Estas células parecen ser seguras de usar en la clínica. Además, en el proyecto desarrollamos un método para añadir un gen terapéutico a las células reprogramadas. El gen terapéutico es una copia correcta del gen que muta en pacientes con una enfermedad genética. Al agregar una copia correcta del gen mutado, las células madre ahora producen un producto genético funcional y están saludables. Las células madre corregidas se pueden utilizar para trasplantarlas al paciente y generar tejidos sanos. Demostramos que las células reprogramadas por nuestro método pueden crecer de tal manera que formen células precursoras musculares que tienen la capacidad de convertirse en fibras musculares sanas. Agregamos un gen terapéutico a las células reprogramadas que proporciona una copia correcta del gen que está mutado en la forma de distrofia muscular de cinturas extremidades. Estas células madre corregidas se utilizarán en una estrategia para reparar el daño muscular presente en estos pacientes con distrofia muscular.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Creación segura y eficiente de células madre pluripotentes inducidas por humanos sin el uso de retrovirus
Resumen público:
Las células madre embrionarias abren nuevas e interesantes perspectivas para la medicina, porque pueden diferenciarse en cualquier tejido del cuerpo. Por lo tanto, tienen el potencial de usarse para reparar tejidos defectuosos en enfermedades como diabetes, enfermedades cardíacas y trastornos neuronales. Además, las células madre pueden corregirse mediante terapia génica y trasplantarse para tratar una amplia variedad de enfermedades genéticas, como la anemia falciforme. Sin embargo, la investigación con células madre embrionarias ha sido difícil debido a los problemas técnicos y éticos que implica la obtención de estas células a partir de embriones humanos, así como a la necesidad de trasplantar células que sean inmunocompatibles con el paciente receptor. La solución a estos desafiantes problemas biológicos y éticos puede surgir de hallazgos recientes que muestran que las células que se comportan como células madre embrionarias pueden derivarse de células ordinarias que se obtienen fácilmente de un paciente, como las células de la piel. Este proceso se conoce como reprogramación. Este avance significa que es posible que ya no se necesiten embriones para generar las células madre necesarias para nuevas terapias interesantes. Sin embargo, la metodología que se utiliza actualmente para crear células reprogramadas implica introducir muchos virus en las células de los pacientes. Este procedimiento es en sí mismo peligroso y puede provocar tumores y otras anomalías en las células. Como resultado, las células reprogramadas creadas hasta la fecha no son aptas para su uso en la clínica. Esta propuesta busca resolver este problema creando un método novedoso para introducir los genes de reprogramación en un lugar seguro de los cromosomas que no tendrá efectos adversos en las células. En estos experimentos se desarrollará una forma sencilla y segura de producir células reprogramadas sin virus. Las células reprogramadas obtenidas mediante este método se probarán minuciosamente para garantizar que tengan todas las propiedades beneficiosas de las células madre embrionarias y que sean seguras de usar. Se hará hincapié en la generación de células humanas reprogramadas que sean seguras y eficaces en terapias. También se generarán células de ratón reprogramadas para utilizarlas en pruebas en ratones antes de los ensayos clínicos en humanos. Se evaluará la capacidad de las células reprogramadas para diferenciarse en cultivo en tejidos como células nerviosas, cardíacas y sanguíneas. Luego se probará la capacidad de las células para curar un trastorno genético en un modelo de ratón. El éxito de estos experimentos proporcionará un método sencillo y seguro para generar células madre reprogramadas y acelerará el uso de estas células en una amplia variedad de aplicaciones clínicas.
Declaración de beneficio para California:
Las células madre pluripotentes humanas derivadas de células adultas ordinarias son un avance científico que podría acelerar los avances médicos para el público. Estas células madre “reprogramadas”, elaboradas a partir de células ordinarias, podrían superar los impasses técnicos y éticos que han retrasado los avances con las células madre derivadas de embriones humanos. Sin embargo, los métodos actuales para hacer células reprogramadas utilizan virus que son en sí mismos peligrosos. Esta propuesta aplicará una nueva tecnología inventada en California, en forma de un novedoso sistema de adición de genes, para crear un método fácil y seguro para producir células madre reprogramadas sin el uso de virus. Al reemplazar los ~20 sitios de integración viral aleatorios actuales con un sitio de integración definido y seguro, es probable que las células madre resultantes sean adecuadas para uso clínico, sin temor a tumores u otras anomalías. Este proyecto es factible en todos sus elementos, muy relevante para los objetivos de CIRM y dará como resultado una variedad de nuevas líneas de células madre humanas pluripotentes. La disponibilidad de células madre de alta calidad, obtenidas a partir de tejido común de pacientes, permitirá a los investigadores avanzar más rápidamente para desarrollar terapias con células madre seguras y efectivas para la población de California. Este proyecto altamente innovador podría suponer un gran paso adelante en todo el campo de las células madre y acelerar enormemente las aplicaciones clínicas. Por tanto, esta aplicación es de gran importancia para California.
