El mundo de los pequeños ARN no codificantes (ncRNA) se expande continuamente, lo que refuerza la importancia biológica de estas especies tanto en el desarrollo como en las enfermedades. Durante el año pasado, nuestros esfuerzos financiados por CIRM se centraron en estudiar las funciones de estos pequeños ncRNA en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de las células madre. Los miARN son una clase de ncRNA pequeños y novedosos que regulan negativamente la expresión genética global a nivel postranscripcional. Utilizando estudios de expresión, hemos caracterizado los perfiles de expresión de miARN tanto en células ES como en células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Este esfuerzo condujo a la identificación de múltiples miARN cuyos niveles de expresión se enriquecen o disminuyen durante la reprogramación de las células madre. Un hallazgo clave del período de financiación anterior es la identificación de un nuevo miARN, Esdmir-1, cuya pérdida de función promueve significativamente la reprogramación de las células iPS. Este es un hallazgo importante, no sólo establece un paradigma para nuestros estudios futuros, sino que también proporciona una metodología atractiva para mejorar la reprogramación de iPS en humanos. Nuestro esfuerzo futuro en el próximo período de financiación (año 2) se centrará en completar los estudios sobre Esdmir-1, evaluar las funciones de miARN candidatos adicionales en la autorrenovación y diferenciación de células madre e identificar nuevos ncRNA que regulen la biología de las células madre.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
El mundo de los pequeños ARN no codificantes (ncRNA) se expande continuamente, lo que refuerza la importancia biológica de estas especies tanto en el desarrollo como en las enfermedades. Durante el año pasado, nuestros esfuerzos financiados por CIRM se centraron en estudiar las funciones de estos pequeños ncRNA en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de las células madre. Los miARN son una clase de ncRNA pequeños y novedosos que regulan negativamente la expresión genética global a nivel postranscripcional. Utilizando estudios de expresión, hemos caracterizado los perfiles de expresión de miARN tanto en células ES como en células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Este esfuerzo condujo a la identificación de múltiples miARN cuyos niveles de expresión se enriquecen o disminuyen durante la reprogramación de las células madre. Un hallazgo clave del período de financiación anterior es la identificación de una familia de miARN novedosos que promueven la diferenciación en células madre pluripotentes. Este es un hallazgo importante porque demostramos que la represión de estos miARN mejora significativamente la eficiencia de la reprogramación. Las funciones de los miARN pueden modularse mediante la transfección transitoria de un antagonista basado en oligonucleótidos; por lo tanto, es probable que nuestros hallazgos conduzcan a un enfoque para promover en gran medida la generación de iPSC en la aplicación clínica. Nuestro esfuerzo futuro en el próximo período de financiación (año 3) se centrará en las caracterizaciones funcionales de miARN adicionales en la autorrenovación y diferenciación de células madre y en la identificación de nuevos ncRNA que regulan la biología de las células madre.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Hasta ahora, nuestro proyecto financiado por CIRM ha proporcionado pruebas sólidas que sugieren que los miARN son reguladores genéticos esenciales en la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre embrionarias, desempeñando así un papel importante en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Se han logrado varios avances importantes para el año 3. En resumen, hemos caracterizado cuidadosamente las funciones de los miARN de miR-34 en la reprogramación somática e indicado la importancia de la inhibición de miR-34 en la promoción de la autorrenovación de las células madre y la reprogramación somática. Además, completamos dos pantallas funcionales para identificar miARN cuya sobreexpresión o inhibición regula la autorrenovación y la diferenciación de las células ES. Se ha realizado una validación funcional para la mayoría de los accesos a la pantalla. En particular, hemos identificado un miARN, miR-meso, que promueve específicamente la diferenciación del mesodermo y reprime la diferenciación del ectodermo. Finalmente, utilizando tecnología de recombinación, hemos construido un BAC con Lin28 etiquetado con Flag en su locus endógeno. También hemos construido un vector piggy bac que nos permite generar una línea de células ES integrada de forma estable que expresa LIN28 etiquetado con Flag para la identificación de nuevos ARN no codificantes unidos a LIN28. Estos avances mejoraron significativamente nuestra comprensión sobre las funciones de los ARN no codificantes en la regulación de la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre, y pueden conducir a una estrategia novedosa para generar células madre humanas completamente pluripotentes para aplicaciones clínicas. En 2011, una parte de nuestros resultados financiados por el proyecto CIRM se publicaron en Nature Cell Biology como artículo de portada, y también presentamos una solicitud de patente que informaba sobre una estrategia novedosa para aumentar la eficiencia de la reprogramación somática.
Período de información:
Los estudiantes de Year 4
Nuestro proyecto financiado por CIRM ha proporcionado pruebas sólidas que sugieren que los microARN (miARN) y, en una perspectiva más amplia, los ARN no codificantes, son reguladores genéticos esenciales en la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre embrionarias. Aunque los ARN no codificantes, incluidos los miARN, no tienen capacidad de codificación de proteínas, poseen fuertes efectos en la regulación. Utilizando enfoques genómicos, cultivo de células madre embrionarias y cultivo de células madre pluripotentes inducidas y biología molecular, pudimos detectar, identificar y caracterizan una serie de ARN no codificantes, en particular microARN, como reguladores importantes para la autorrenovación y diferenciación de las células madre. Nuestros resultados pueden tener profundas implicaciones sobre el papel de los ncRNA en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Se han logrado varios avances importantes para el año 4 de nuestro proyecto financiado por CIRM. .
El año pasado, llevamos a cabo con éxito una evaluación funcional para identificar miARN con funciones importantes en la regulación de la autorrenovación de las células ES. Entre los candidatos a miARN que surgieron de esta pantalla, nos centramos principalmente en la caracterización funcional y mecanística de varios reguladores de miARN importantes para la pluripotencia de las células ES. Investigamos las funciones de los miARN miR-34, cuya deficiencia promueve significativamente la reprogramación somática. Estudiamos el papel de miR-34 en la remodelación epigenética durante la reprogramación somática. También estudiamos la función del grupo mir-290-295, que constituye la mayoría de las especies de miARN en las células ES. Generamos células ES deficientes para el grupo de miARN mir-290-295 para caracterizar sus efectos sobre la autorrenovación de las células ES, y también exploramos la redundancia funcional de los miARN de la familia mir-290-295 mediante una familia de miARN relacionada funcionalmente caracterizada, incluida la miARN mir17-92.
En el período de financiación anterior, también llevamos a cabo un análisis para identificar miARN o ARN no codificante con funciones importantes en la regulación de la diferenciación de las células ES. Aquí, caracterizamos funcionalmente los efectos de miR-meso en la diferenciación del mesodermo tanto in vitro como in vivo, utilizando ensayos de teratoma y células KO ES. Además, identificamos un ncRNA largo que exhibe un patrón de expresión interesante durante la diferenciación de las células ES. Caracterizamos su alteración de expresión única durante la diferenciación de las células ES y actualmente estamos generando células ES knockout para este ncRNA largo para investigar más a fondo su función. Finalmente, caracterizamos los perfiles de expresión de miARN durante la diferenciación de células ES a células madre de epiblasto e identificamos miARN candidatos adicionales que regulan la salida de la pluripotencia de las células ES durante su diferenciación.
Finalmente, establecimos con éxito el sistema biológico para generar iPSC humanas a partir de fibroblastos dérmicos humanos y utilizaremos este sistema para explorar el papel de ncRNA específicos en la reprogramación somática humana. Nuestros resultados anteriores utilizando células ES de ratón e iPSC nos han preparado bien para explorar la importancia de nuestro hallazgo en humanos. Éste será uno de los objetivos principales a alcanzar en nuestro último período de financiación.
Período de información:
Los estudiantes de Year 5
Nuestro proyecto financiado por CIRM ha proporcionado pruebas sólidas que sugieren que los miARN y, en una perspectiva más amplia, los ARN no codificantes, son reguladores genéticos esenciales en la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre embrionarias. Consistentemente, estos ncRNA desempeñan un papel importante en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Utilizando estudios de expresión, cribado funcional y enfoques candidatos, hemos identificado y caracterizado las funciones de múltiples miRNA y ncRNA largos (lncRNA) en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de células madre pluripotentes. Estos ARN no codificantes son un componente esencial de una red reguladora que regula el potencial de destino, la autorrenovación y el potencial de diferenciación de las células madre.
Período de información:
NCE
Nuestro proyecto financiado por CIRM ha proporcionado pruebas sólidas que sugieren que los miARN y, en una perspectiva más amplia, los ARN no codificantes, son reguladores genéticos esenciales en la autorrenovación y la pluripotencia de las células madre embrionarias. Consistentemente, estos ncRNA desempeñan un papel importante en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Utilizando estudios de expresión, cribado funcional y enfoques candidatos, hemos identificado y caracterizado las funciones de múltiples miRNA y ncRNA largos (lncRNA) en la regulación de la autorrenovación y diferenciación de células madre pluripotentes. Estos ARN no codificantes son un componente esencial de una red reguladora que regula el potencial de destino, la autorrenovación y el potencial de diferenciación de las células madre. En los últimos 6 años financiados por CIRM, nuestro equipo identificó miARN/ncARN que mejoran/suprimen la autorrenovación de las células madre pluripotentes y aquellos que expanden/restringen el potencial de diferenciación de las células madre pluriptotentes. Estos hallazgos han revelado nuevos reguladores de la biología de las células madre pluripotentes y allanan el camino para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico y agentes terapéuticos.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
El papel de los ARN no codificantes en la autorrenovación y diferenciación de células madre pluripotentes
Resumen público:
Hay miles de tipos de células en el cuerpo animal, muchas de las cuales pueden derivarse de células madre embrionarias (células ES), un tipo de célula pluripotente que prospera en condiciones de cultivo celular. Las células ES se diferencian en varios tipos de células en una placa de cultivo de tejidos en respuesta a diferentes tratamientos con factores de crecimiento/citocinas, que pueden trasplantarse nuevamente a animales para su aplicación en medicina regenerativa. En los últimos años, los científicos han generado otro tipo de población de células madre pluripotentes, denominadas células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Estas células iPS se derivan de tipos de células adultas y son capaces de diferenciarse en una variedad de tipos de células en una placa de cultivo de tejidos. Tanto las células ES como las iPS no sólo proporcionan un paradigma único para estudiar el desarrollo temprano de los mamíferos, sino que también son muy prometedoras para la medicina regenerativa. Por lo tanto, comprender la red molecular que regula el mantenimiento de las células madre y la diferenciación de estas células madre es muy importante para su aplicación en la medicina regenerativa. En los estudios que propusimos, examinaremos una nueva clase de reguladores de genes por sus funciones para mantener la población de células madre, así como para desencadenar su diferenciación en linajes específicos. El foco de nuestros estudios son los ARN no codificantes, que son moléculas de ARN que no tienen capacidad para codificar proteínas. Entre los ARN no codificantes mejor estudiados se encuentran los microARN, que son pequeñas moléculas de ARN que son un potente regulador de la expresión genética. Estos pequeños ARN a menudo tienen la capacidad de regular cada uno cientos de genes y, por lo tanto, regulan diversos procesos de desarrollo y procesos fisiológicos. Si se elimina la biogénesis de estos pequeños ARN, las células madre presentan múltiples defectos tanto en la placa de cultivo de tejidos como en el desarrollo animal. En esta propuesta, nuestro objetivo es investigar las funciones de los ARN no codificantes en la regulación del mantenimiento y diferenciación de las células madre, e identificar nuevos reguladores de ARN no codificantes que puedan afectar la biología de las células madre. Vale la pena señalar que las terapias con ARN, en particular aquellas que utilizan ARN pequeños sintéticos o sus inhibidores, evitan la necesidad de la terapia génica convencional y son muy prometedoras para la aplicación clínica. Los métodos para administrar ARN pequeños en células y animales han mejorado significativamente durante la última década, y es muy probable que pronto se utilicen ARN pequeños y sus inhibidores para aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, nuestra investigación propuesta generará hallazgos interesantes para la biología de las células madre y puede conducir al desarrollo de nuevos marcadores de diagnóstico y enfoques terapéuticos para la medicina regenerativa.
Declaración de beneficio para California:
Los estudios propuestos aquí exploran las funciones de nuevos ARN no codificantes en la autorrenovación y diferenciación de células madre pluripotentes. Esta es una nueva área de investigación con células madre que, si se financia, puede beneficiar al estado de California para desarrollar nuevos marcadores de diagnóstico y enfoques terapéuticos en medicina regenerativa. adquirir conocimientos sobre las bases moleculares de la pluripotencia y formar a jóvenes científicos en biología de células madre. A continuación, se resumen en detalle los beneficios de la investigación propuesta para el estado de California y sus ciudadanos. Las células madre pluripotentes no sólo proporcionan un paradigma único para estudiar el desarrollo temprano de los mamíferos, sino que también son muy prometedoras para la medicina regenerativa. Las terapias con ARN son un área de intensa investigación y los métodos de administración in vitro e in vivo de moléculas de ARN han mejorado enormemente en los últimos años. Por lo tanto, en un futuro próximo es posible utilizar la terapia con ARN, en particular aquellas que involucran ARN pequeños o sus inhibidores, para la medicina regenerativa. La terapia con ARN es fundamentalmente diferente del factor de crecimiento “convencional” o de la administración de citoquinas para modular las células madre/progenitoras. La terapia con ARN por sí sola, o en combinación con la terapia convencional, puede proporcionar un enfoque novedoso para la medicina regenerativa. Además, los estudios de ARN no codificantes en células madre pueden dar lugar a nuevos marcadores para las células madre, así como a sus linajes diferenciados. La investigación propuesta examinará cuidadosamente las funciones de los ARN no codificantes en la regulación de la pluripotencia de las células madre, un campo que se encuentra en su infancia. No solo el conocimiento adquirido en este estudio mejorará nuestra comprensión de las bases moleculares para el mantenimiento y la diferenciación de las células madre, sino que las nuevas herramientas de investigación desarrolladas a partir de este estudio también beneficiarán la investigación de células madre en el estado de California y su gente. Además, la investigación propuesta permitirá a los jóvenes científicos recibir una buena formación en el campo de las células madre y combinar dos apasionantes campos de la biología, es decir, la biología del ARN no codificante y la biología de las células madre. Y dicha capacitación será fundamental para que el estado de California tenga su propia fuerza de investigación sobre biología de células madre en el futuro.
