Transducción de proteínas de factores de transcripción: un enfoque no genético para generar nuevas líneas celulares pluripotentes a partir de piel humana.

La generación de líneas de células madre humanas pluripotentes (iPS) requiere la expresión de entre 3 y 5 factores de transcripción. Sin embargo, las mutaciones somáticas preexistentes y las mutaciones adquiridas a partir de vectores de ADN desnudos o virales integrados utilizados para introducir estos factores de transcripción plantean un riesgo considerable de cáncer y representan el principal obstáculo para trasladar la terapia con células madre a la clínica. Para superar este obstáculo, propusimos un enfoque alternativo para generar líneas de células madre derivadas de pacientes utilizando factores de transcripción inductores de pluripotencial permeables a las células. La introducción de proteínas activas en las células evita el riesgo a largo plazo de mutaciones genéticas causadas por vectores de expresión de estos factores de transcripción basados ​​en el ADN. Nuestros laboratorios fueron pioneros en la administración de proteínas permeables a las células, incluidos factores de transcripción, en las células. Después de dominar el enfoque de administración en fibroblastos humanos de prueba, centraremos nuestros esfuerzos en varios tipos de células de fácil acceso a partir de biopsias de piel. Para utilizar nuestra tecnología de suministro de proteínas para la generación de células iPS a partir de células de la piel, es necesario alcanzar varios objetivos. En primer lugar, se diseñaron proteínas de cinco factores de transcripción pluripotentes (Oct4, Nanog, Sox2, Klf4, Myc y Lin28) para contener el dominio de administración permeable a las células o dominio de transducción de proteínas (PTD) y se produjeron en grandes cantidades en el laboratorio. En segundo lugar, para probar la actividad de cada factor de transcripción pluripotente permeable a las células, hemos evaluado su capacidad para ingresar al núcleo y activar objetivos genéticos específicos. Hemos encontrado varios problemas, relacionados principalmente con los niveles de expresión y la retención de la actividad transcripcional. Nuestro trabajo actual sugiere que la ubicación o ubicación física del dominio de entrega permeable a las células puede interferir con la actividad óptima del factor de transcripción. Para optimizar la actividad, se han generado proteínas de fusión adicionales y se determinarán los niveles intracelulares y la actividad transcripcional. Otra posibilidad de una actividad deficiente es la captura de proteínas permeables a las células en los compartimentos endosómicos, lo que impide el tráfico nuclear eficiente. Anteriormente hemos utilizado proteínas adicionales para facilitar el escape de las proteínas permeables a las células de estos compartimentos y, por lo tanto, se están analizando varios péptidos y fármacos para determinar su capacidad para mejorar la orientación de las proteínas recombinantes permeables a las células. Otro área de progreso ha sido el aislamiento de células de diferentes compartimentos de la piel. Los fibroblastos de la piel son extremadamente heterogéneos, por lo que los fibroblastos de diferentes capas de la piel, p. ej. papilar vs. dermis reticular, se están aislando y evaluando para determinar diferencias en su eficiencia en la selección de proteínas permeables a las células. Se están analizando los cultivos actuales para confirmar el origen de estas células y se probará su actividad contra los factores de transcripción permeables a las células descritos anteriormente. Además, durante el año pasado, se identificaron varias poblaciones nuevas de células madre adultas en el folículo piloso. Los esfuerzos del próximo año serán aislar estas poblaciones para pruebas similares de direccionamiento de proteínas permeables a las células y eficiencia para convertirse en células iPS. Otro aspecto importante de la generación de iPS es la proporción de cada factor de transcripción pluripotente con respecto al otro. Utilizando un enfoque sustituto, hemos realizado matrices extensas para variar cada factor de transcripción en relación con el otro y ahora hemos identificado la proporción óptima. Este es un paso clave para optimizar la generación de inducción de células iPS. En general, hemos logrado avances significativos, aunque más lentos de lo esperado, en el diseño y purificación de las proteínas de fusión del factor de transcripción PTD. Anticipamos que a medida que realicemos más experimentos con estas proteínas de fusión PTD, el trabajo se acelerará rápidamente durante el segundo año.

Resumen público del progreso científico (11/01/11) Número de subvención: RL-0644-01 Nombre del PI: Dowdy, Steven F. Título del proyecto: Transducción de proteínas de factores de transcripción: un enfoque no genético para generar nuevas líneas celulares pluripotentes a partir de piel humana. La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) abre la puerta a nuevas aplicaciones y descubrimientos prometedores de terapias celulares médicas. Sin embargo, en la práctica, la generación de células iPS humanas pluripotentes requiere la expresión simultánea y coordinada de una combinación de tres a cinco o más factores de reprogramación que a menudo son factores de transcripción. Uno de los principales obstáculos para traducir la tecnología de generación de iPS a partir de descubrimientos científicos básicos en terapias celulares seguras para los pacientes es el riesgo de adquirir mutaciones de vectores virales y de ADN que se utilizan para generar células pluripotentes. Por lo tanto, el riesgo de mutaciones genómicas de vectores de ADN desnudos o virales integrados utilizados para introducir estos factores de transcripción plantea un riesgo considerable de cáncer y representa el principal obstáculo para trasladar la terapia con células madre a las clínicas. Para superar este obstáculo, inicialmente propusimos un enfoque alternativo para generar líneas de células madre derivadas de pacientes utilizando proteínas de factores de transcripción inductoras de pluripotencia permeables a las células. Es importante destacar que la introducción de proteínas activas en las células evita el riesgo a largo plazo de mutaciones genéticas causadas por vectores de expresión basados ​​en el ADN de estos factores de transcripción. Nuestros laboratorios fueron pioneros en la administración de proteínas permeables a las células, incluidos factores de transcripción en las células, y el objetivo general aquí es utilizar este enfoque epigenético (sin vector de ADN) para generar de manera eficiente células iPS a partir de varios tipos de células de fácil acceso a partir de biopsias de piel. Nuestro primer enfoque fue utilizar nuestra tecnología de administración de proteínas para generar, producir y purificar las proteínas de fusión de cinco factores de reprogramación pluripotentes, a saber, Oct4, Nanog, Sox2, Klf4, Myc y Lin28. Diseñamos estas proteínas para que contengan un dominio de entrega permeable a las células o dominio de transducción de proteínas (PTD) y las producimos en grandes cantidades en el laboratorio. Sin embargo, cuando comenzamos a probar exhaustivamente la capacidad de estas proteínas para ingresar al núcleo y activar genes diana específicos para inducir la expresión, encontramos varios problemas. En primer lugar, estas proteínas no eran solubles en soluciones acuosas y tendían a agregarse. Esto se superó con las formulaciones que utilizamos, incluida la adición de sal. En segundo lugar, con la excepción de la proteína de fusión del factor de transcripción PTD-Sox2, no pudimos demostrar que las otras proteínas de fusión del factor de transcripción conservaran su capacidad de transactivar o inducir genes diana. Este fue un obstáculo importante y, si bien sentimos que finalmente podríamos tener éxito en producir proteínas de fusión biológicamente activas, similares a las más de 40 que hemos creado en los últimos 10 años, reconocimos que este enfoque iba a tomar mucho más tiempo para lograr nuestro objetivo. de generación epigenética (sin ADN) de células iPS. Entonces, el problema estaba en la estabilidad y actividad de las proteínas de fusión del factor de transcripción y el tiempo que llevaría resolver estos problemas. Para evitar estos problemas, decidimos adoptar un enfoque alternativo y desarrollar desde cero un enfoque de administración de ARNm universal, eficiente y no citotóxico. Es importante destacar que los ARNm no son ADN y no se integran en los cromosomas y, por lo tanto, siguen siendo epigenéticos. Además, los ARNm tienen una vida relativamente larga dentro de las células y se traducen repetidamente en proteínas, amplificando así la cantidad de factores de reprogramación pluripotentes que se expresarían dentro de la célula diana. Por último, independientemente de la proteína que codifique el ARNm, los ARNm tienen propiedades biofísicas similares, lo que hace que el desarrollo de un enfoque de administración universal de ARNm sea infinitamente más fácil. Por tanto, la administración de ARNm es un enfoque epigenético para generar células iPS y tiene múltiples ventajas sobre las proteínas de fusión de factores de transcripción. Para desarrollar un enfoque universal de administración de ARNm, primero condensamos y compactamos el ARNm con un péptido, llamado péptido HK, formando una pequeña nanopartícula y luego la cubrimos con un segundo péptido de administración de PTD. Después de un desarrollo extenso, el resultado es que hemos desarrollado un enfoque universal de administración de ARNm que logra una administración de >90% de ARNm en una variedad de células primarias de una manera no citotóxica y se puede administrar repetidamente. Un artículo reciente que utiliza lípidos (agentes de transfección de liposomas) ha demostrado que el enfoque del ARNm puede funcionar. Sin embargo, los liposomas son citotóxicos para las células y los autores observaron que era extremadamente difícil hacerlo. Actualmente estamos probando nuestro enfoque universal de administración de ARNm para generar epigenéticamente células iPS.

La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) abre la puerta a nuevas aplicaciones y descubrimientos prometedores de terapias celulares médicas. Sin embargo, en la práctica, la generación de células iPS humanas pluripotentes requiere la expresión simultánea y coordinada de una combinación de tres a cinco o más factores de reprogramación que a menudo son factores de transcripción. Uno de los principales obstáculos para traducir la tecnología de generación de iPS a partir de descubrimientos científicos básicos en terapias celulares seguras para los pacientes es el riesgo de adquirir mutaciones de vectores virales y de ADN que se utilizan para generar células pluripotentes. Por lo tanto, el riesgo de mutaciones genómicas de vectores de ADN desnudos o virales integrados utilizados para introducir estos factores de transcripción plantea un riesgo considerable de cáncer y representa el principal obstáculo para trasladar la terapia con células madre a las clínicas. Para superar este obstáculo, inicialmente propusimos un enfoque alternativo para generar líneas de células madre derivadas de pacientes utilizando proteínas de factores de transcripción inductoras de pluripotencia permeables a las células. Es importante destacar que la introducción de proteínas activas en las células evita el riesgo a largo plazo de mutaciones genéticas causadas por vectores de expresión basados ​​en el ADN de estos factores de transcripción. Nuestros laboratorios fueron pioneros en la administración de proteínas permeables a las células, incluidos factores de transcripción en las células, y el objetivo general aquí es utilizar este enfoque epigenético (sin vector de ADN) para generar de manera eficiente células iPS a partir de varios tipos de células de fácil acceso a partir de biopsias de piel. Nuestro primer enfoque fue utilizar nuestra tecnología de administración de proteínas para generar, producir y purificar las proteínas de fusión de cinco factores de reprogramación pluripotentes, a saber, Oct4, Nanog, Sox2, Klf4, Myc y Lin28. Diseñamos estas proteínas para que contengan un dominio de entrega permeable a las células o dominio de transducción de proteínas (PTD) y las producimos en grandes cantidades en el laboratorio. Sin embargo, cuando comenzamos a probar exhaustivamente la capacidad de estas proteínas para ingresar al núcleo y activar genes diana específicos para inducir la expresión, identificamos varios problemas. En primer lugar, estas proteínas no eran solubles en soluciones acuosas y tendían a agregarse. Esto se superó con las formulaciones que utilizamos, incluida la adición de sal. En segundo lugar, con la excepción de la proteína de fusión del factor de transcripción PTD-Sox2, no pudimos demostrar que las otras proteínas de fusión del factor de transcripción conservaran su capacidad de transactivar o inducir genes diana. Este fue un obstáculo importante y, si bien sentimos que finalmente podríamos tener éxito en producir proteínas de fusión biológicamente activas, similares a las más de 40 que hemos creado en los últimos 10 años, reconocimos que este enfoque iba a tomar mucho más tiempo para lograr nuestro objetivo. de generación epigenética (sin ADN) de células iPS. Para evitar estos problemas, decidimos adoptar un enfoque alternativo y desarrollar desde cero un enfoque de administración de ARNm universal, eficiente y no citotóxico. Es importante destacar que los ARNm no son ADN y no se integran en los cromosomas y, por lo tanto, siguen siendo epigenéticos. Además, los ARNm tienen una vida relativamente larga dentro de las células y se traducen repetidamente en proteínas, amplificando así la cantidad de factores de reprogramación pluripotentes que se expresarían dentro de la célula diana. Por último, independientemente de la proteína que codifique el ARNm, los ARNm tienen propiedades biofísicas similares, lo que hace que el desarrollo de un enfoque de administración universal de ARNm sea infinitamente más fácil. Por tanto, la administración de ARNm es un enfoque epigenético para generar células iPS y tiene múltiples ventajas sobre las proteínas de fusión de factores de transcripción. Primero, desarrollamos un enfoque de administración de ARNm universal que condensaba y compactaba el ARNm con un péptido, llamado péptido HK, formando una pequeña nanopartícula y luego la recubría con un segundo péptido de administración de PTD. Después de un desarrollo extenso, el resultado es que hemos desarrollado un enfoque universal de administración de ARNm que logra una administración de >90% de ARNm en una variedad de células primarias de una manera no citotóxica y se puede administrar repetidamente. En segundo lugar, desarrollamos un replicón de ARNm largo que es una única especie de ARNm que codifica internamente cuatro factores de reprogramación pluripotentes independientes. La introducción de este ARN tres veces en células humanas primarias da como resultado una generación robusta y altamente reproducible de células iPS humanas. Hemos utilizado dos colecciones diferentes de factores de reprogramación para mostrar cuán eficientemente funciona el sistema. En general, logramos los objetivos de esta subvención para desarrollar un enfoque epigenético para generar células iPS. Prevemos que el enfoque del replicón de ARN se utilizará ampliamente en la investigación con células madre y, potencialmente, en la generación de terapias con células madre en el futuro.