Aislamiento prospectivo de células madre hematopoyéticas y de cardiomiocitos derivadas de hESC

Los objetivos de nuestra propuesta son el aislamiento de células madre formadoras de sangre y corazón a partir de cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC) y la generación de anticuerpos monoclonales (mAb) que eliminen células teratogénicas residuales de poblaciones trasplantables de hESC diferenciadas. Para el aislamiento de progenitores, planteamos la hipótesis de que los precursores derivados de hESC podrían identificarse y aislarse utilizando mAb que marcan combinaciones únicas de moléculas de superficie celular específicas del linaje. Utilizamos cientos de mAb definidos, generamos cientos de nuevos mAb anti-hESC y los utilizamos para aislar y caracterizar docenas de poblaciones derivadas de hESC. Descubrimos cuatro tipos de precursores de las primeras etapas de las células en diferenciación, cada uno de los cuales expresa genes indicativos de compromiso con los tejidos embrionarios o extraembrionarios. En conjunto, estos progenitores son candidatos a dar lugar a linajes mesoendodérmicos (corazón, sangre, páncreas, etc.) y al saco vitelino, al cordón umbilical y a los tejidos placentarios, respectivamente. Es importante destacar que hemos descubierto que las células de la población mesoendodérmica dan lugar a cardiomiocitos latentes. Actualmente estamos enriqueciendo precursores de cardiomiocitos de esta población utilizando marcadores genéticos específicos del corazón, y estamos analizando los progenitores putativos mediante ensayos electrofisiológicos y mediante trasplante en corazones de animales (una prueba para restaurar la función cardíaca). Además, establecimos condiciones in vitro que promueven eficazmente la diferenciación de hESC hacia los linajes hematopoyéticos (sangre) y poblaciones aisladas que se asemejan a las células madre hematopoyéticas (HSC) tanto en el fenotipo de superficie como en los potenciales de linaje, según lo determinado por ensayos in vitro. Hemos generado líneas hESC que expresan el gen antiapoptótico BCL2 y hemos descubierto que estas células producen cantidades significativamente mayores de células hematopoyéticas y cardíacas, debido a su mayor supervivencia durante el cultivo y la clasificación. Actualmente estamos aislando precursores hematopoyéticos de BCL2-hESC y probaremos su capacidad para injertarse en ratones inmunodeficientes, para examinar la capacidad de las HSC derivadas de hESC para regenerar el sistema sanguíneo. Finalmente, hemos utilizado los nuevos mAb que preparamos contra hESC indiferenciadas para agotar las células teratogénicas residuales de cultivos diferenciados que se trasplantaron a modelos animales. Descubrimos que después del agotamiento rara vez se formaba teratoma y esperamos determinar un cóctel final de mAb para la eliminación de células teratogénicas de los productos de trasplante este año.

El principal objetivo de nuestra propuesta es aislar células madre terapéuticas y progenitores a partir de células madre embrionarias humanas (hESC) que dan lugar a células sanguíneas y cardíacas. Nuestro enfoque implica el aislamiento de un subconjunto de células precursoras diferenciadas utilizando anticuerpos monoclonales mAb e instrumentos de clasificación de células, y la posterior caracterización de su respectivo potencial hematopoyético y cardiomiogénico en cultivo, así como después del injerto en modelos de enfermedad en ratones. Además, nuestro objetivo es desarrollar mAb que se unan específicamente a hESC indiferenciadas para eliminar células residuales que inician teratoma de preparaciones de células terapéuticas, para garantizar la seguridad del trasplante. Hemos logrado avances sustanciales hacia el logro de estos objetivos. En primer lugar, descubrimos que la diferenciación inicial de las hESC se produce a través de sólo 4 o 5 tipos de progenitores diferentes, de los cuales uno está destinado a dar lugar a linajes cardíacos. Purificamos esta población utilizando tres nuevos marcadores de superficie celular y encontramos un enriquecimiento significativo de clones de cardiomiocitos en los ensayos de formación de colonias que desarrollamos. Este subconjunto también expresaba niveles particularmente altos de genes cardíacos y era receptivo a una mayor diferenciación en cardiomiocitos latientes o células endoteliales vasculares. Cuando se trasplantaron a ratones inmunodeficientes, estos progenitores se diferenciaron en miocitos ventriculares y células endoteliales vasculares. El próximo año realizaremos experimentos de trasplantes para evaluar si mejoran el resultado funcional del infarto de corazón en corazones de ratones. En segundo lugar, hemos optimizado las condiciones de cultivo celular y los marcadores de superficie celular para clasificar los progenitores hematopoyéticos derivados de hESC. También hemos comenzado a trasplantar estas poblaciones a ratones receptores inmunodeficientes para identificar poblaciones hematopoyéticas reconstituyentes de la sangre. En tercer lugar, identificamos 5 mAb comerciales y 1 personalizado que son específicos de células pluripotentes humanas (hESC y células pluripotentes inducidas). Actualmente estamos probando la capacidad de combinaciones de 3 marcadores de superficie de pluripotencia para eliminar todas las células iniciadoras de teratoma de poblaciones de células diferenciadas trasplantadas. En resumen, esperamos proporcionar una validación funcional de las poblaciones de precursores sanguíneos y cardíacos que identificamos a partir de hESC al final del plazo de esta subvención.

El principal objetivo de nuestra propuesta es aislar células madre y progenitoras terapéuticas derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) que puedan dar lugar a células sanguíneas y cardíacas. Nuestro enfoque implica el desarrollo de protocolos de diferenciación para impulsar el desarrollo hematopoyético (sangre) y cardíaco (corazón) de hESC, luego identificar y aislar células madre/progenitoras utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para marcadores de superficie expresados ​​en la sangre y en células madre/progenitoras del corazón. y finalmente caracterizar sus propiedades funcionales in vitro e in vivo. Además, buscamos desarrollar mAb que se unan específicamente a hESC indiferenciadas para eliminar células iniciadoras de teratoma (tumor) residuales de preparaciones terapéuticas, para garantizar la seguridad del trasplante. Hemos logrado avances sustanciales hacia el logro de estos objetivos. En primer lugar, descubrimos que la diferenciación inicial de las hESC se produce a través de sólo 4 o 5 tipos de progenitores diferentes, de los cuales uno está destinado a dar lugar a linajes cardíacos. Purificamos esta población utilizando cuatro nuevos marcadores de superficie celular (ROR2, PDGFRα, KDR y CD13) y encontramos un enriquecimiento significativo de clones de cardiomiocitos en los ensayos de formación de colonias que desarrollamos. Este subconjunto también expresaba niveles particularmente altos de genes cardíacos y era receptivo a una mayor diferenciación en cardiomiocitos latientes o células endoteliales vasculares. Cuando se trasplantaron a ratones inmunodeficientes, estos progenitores se diferenciaron en miocitos ventriculares y células endoteliales vasculares. También hemos desarrollado con éxito un modelo de xenoinjerto de corazón fetal humano para probar células madre/progenitoras de cardiomiocitos derivadas de hESC en tejido cardíaco humano para determinar su injerto y función. En segundo lugar, hemos optimizado las condiciones de cultivo celular y los marcadores de superficie celular para clasificar los progenitores hematopoyéticos derivados de hESC. Al hacerlo, hemos mapeado las primeras etapas de especificación y compromiso hematopoyético de un precursor hematoendotelial bipotente. Nuestras condiciones de cultivo impulsan una fuerte diferenciación hematopoyética in vitro, pero estos progenitores hematopoyéticos derivados de hESC no logran un injerto hematopoyético cuando se trasplantan en modelos de ratón. Además, sobreexpresamos la proteína antiapoptótica BCL2 en hESC y descubrimos una mejora significativa en la viabilidad en la clasificación de células individuales, la formación de cuerpos embrioides y en cultivos que carecen de reemplazo de suero. En el futuro, creemos que las ventajas de supervivencia exhibidas por esta línea de hESC que expresa BCL2 mejorarán nuestras posibilidades de injertar células madre/progenitoras hematopoyéticas derivadas de hESC. En tercer lugar, identificamos un cóctel de cinco mAb comerciales y uno nuevo que permiten la identificación específica de células pluripotentes humanas (hESC y células pluripotentes inducidas). Hemos encontrado combinaciones de 3 marcadores de superficie de pluripotencia que pueden eliminar todas las células iniciadoras de teratoma de poblaciones de hESC diferenciadas y de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) antes del trasplante. Si bien estas combinaciones pueden variar según el cultivo de diferenciación, hemos generado un protocolo simple y fácil de seguir para eliminar todas las células teratogénicas de cultivos de diferenciación a gran escala. En resumen, logramos la mayoría de los objetivos establecidos en nuestra propuesta original. Logramos con éxito el injerto cardíaco de un progenitor de cardiomiocitos derivado de hESC utilizando un nuevo modelo de injerto de corazón humano. Si bien lamentablemente no logramos el injerto hematopoyético de células derivadas de hESC, estamos explorando una estrategia para abordar este problema. Nuestra investigación ha dado lugar a cuatro manuscritos: uno sobre los efectos protectores de la expresión de BCL2 en la viabilidad y pluripotencia de las hESC (publicado en PNAS, 2011), otro que describe marcadores de pluripotencia y su uso para reducir el potencial teratogénico en células madre pluripotenciales diferenciadas (aceptado para su publicación en Nature Biotechnology) y dos manuscritos enviados, uno que describe un nuevo ensayo de xenoinjerto para probar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotenciales para el injerto funcional y el otro que describe las primeras decisiones sobre el destino posteriores a una célula madre pluripotencial.