Desarrollo preclínico de un inhibidor de pan Bcl2 para la terapia dirigida con células madre cancerosas

La sobreexpresión de genes de la familia Bcl-2 puede impulsar la supervivencia de las CSC. Los datos recientes de secuenciación de ARN demuestran que las CSC humanas expresan una panoplia de isoformas antiapoptóticas de Bcl-2 en respuesta a señales extrínsecas in vivo, lo que indica que se necesitará un inhibidor de pan Bcl-2 para anular la supervivencia de las CSC. Sabutoclax inhibe el crecimiento de CML CML en crisis blástica injertadas en ratones RAG2-/-c-/- con una citotoxicidad mínima hacia las células bax-/-bak-/-. Debido a que sabutoclax inhibe los seis miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2, incluidas las proteínas Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL, Bfl-1, Bcl-W y Bcl-B, con buena estabilidad química, plasmática y microsomal, anticipamos que tendrá utilidad clínica para apuntar a CSC humanas resistentes a la apoptosis en tumores malignos. Se logró un progreso significativo en los hitos del primer año y hemos logrado avances tempranos en varios hitos proyectados para el año 2. Durante este período de informe de seis meses, sabutoclax obtuvo la licencia de una empresa de biotecnología, Oncothyreon. La licencia estaba anteriormente en manos de Coronado Biosciences. El Dr. Pellecchia (SBMRI) continúa proporcionando sabutoclax al Dr. Jamieson para uso en estudios celulares e in vivo. SBMRI realizó análisis de control de calidad (integridad y pureza) en muestras utilizadas en estudios preclínicos y proporcionó análisis comparativos de compuestos producidos por el CMO producido mediante diferentes métodos de síntesis. Es importante destacar que el proceso de fabricación de sabutoclax se optimizó, lo que permitió ampliar el fármaco. En estudios de formulación se desarrolló y calificó un método que separa impurezas y compuestos de degradación del sabutoclax para la cuantificación del fármaco. Oncothyreon realizó estudios adicionales de solubilidad y estabilidad para identificar una formulación intravenosa que pudiera usarse tanto para estudios no clínicos como clínicos. Oncothyreon también realizó varios estudios piloto de farmacocinética en ratones, ratas y perros, planificados para el año 2. A través de la secuenciación del ARN transcriptoma completo, el Dr. Jamieson demostró que Bcl-W estaba regulado positivamente en los progenitores CP y BC en comparación con los progenitores CB normales. Se confirmaron resultados anteriores de qRT-PCR para Mcl-1, lo que muestra que la isoforma larga se expresaba preferentemente en BC CML. Los resultados de Bcl-2 y Mcl-1 también se confirmaron a nivel de proteína mediante análisis FACS e inmunohistoquímica de la médula ósea (BM) de ratones injertados con LSC CD34+ de CML humana. El tratamiento con Sabutoclax eliminó las células progenitoras de BC CML in vivo e in vitro. La formación de colonias de BC CML (en comparación con las células progenitoras normales) disminuyó con sabutoclax de una manera dependiente de la dosis. Cuando las células de CML se cultivaron conjuntamente con células estromales o en medios condicionados por el estroma, la expresión del ARNm de BCL-2 aumentó y mejoró la formación de colonias. La eliminación de BCL2 endógeno en células BC CML mediante shRNA resultó en una disminución de la formación de colonias. Los resultados preliminares sugieren que la MO es un nicho protector para BC CML CSC y que sabutoclax puede apuntar a estas células protegidas de nicho. En ratones injertados con BC CML, dasatinib aumentó el injerto de células BC CML inactivas en la MO de ratón medido por FACS para los marcadores del ciclo celular. Sabutoclax disminuyó la expresión de las proteínas BCL-2 y MCL1 mediante tinción inmunohistoquímica y disminuyó el CSC de BC CML en reposo en BM; sin embargo, sabutoclax aumentó la tinción de TUNEL en BM, lo que sugiere que, si bien dasatinib puede aumentar el número de CSC de BC CML en reposo, sabutoclax puede hacer lo contrario. Las dosis altas de sabutoclax administradas en combinación con dasatinib dieron como resultado una disminución significativa en el injerto de células humanas en la MO en comparación con dasatinib solo. Los ratones trasplantados en serie con tejidos de ratones tratados con una combinación tuvieron una mayor supervivencia en comparación con los trasplantes en serie de tejidos tratados con un solo agente. Las células CD34+ humanas de la médula ósea de ratones tratados con combinación tenían más células en ciclo que las células CD34+ en comparación con la médula ósea de ratones tratados con dasatinib solo. La frecuencia de LSC de BC CD34+BCL2+ y CD34+MCL1+ fue significativamente menor en BM tratada con una combinación de sabutoclax y dasatinib, lo que sugiere que sabutoclax y dasatinib pueden actuar sinérgicamente para aumentar la supervivencia de los ratones con LMC de BC injertados.

Las células madre cancerosas (CSC) latentes contribuyen a la resistencia terapéutica y la recaída en la leucemia mieloide crónica (LMC) y otras neoplasias malignas recalcitrantes. Los datos acumulados demuestran que la sobreexpresión de las isoformas de empalme pro-supervivencia de la familia BCL2 impulsa la supervivencia inactiva de CSC en la LMC de crisis blástica humana (BC). Los datos de secuenciación del ARN del transcriptoma completo, la matriz de PCR de apoptosis y la qRT-PCR específica de isoformas de empalme demuestran que las CSC humanas expresan isoformas BCL2 largas antiapoptóticas en respuesta a señales extrínsecas en el nicho de la médula, lo que indica que se necesitará un inhibidor pan-BCL2 para anular la supervivencia de las CSC. . Sabutoclax, un nuevo inhibidor de pan BCL2, previene la supervivencia de BC CSC injertadas en ratones RAG2-/-c-/-, de manera proporcional a la regulación negativa de las isoformas y proteínas de empalme de BCL2 que favorecen la supervivencia, y sensibiliza a las CSC a un inhibidor de BCR-ABL, dasatinib. , al tiempo que ejerce una citotoxicidad mínima hacia las células madre hematopoyéticas normales. Debido a que sabutoclax inhibe a los seis miembros antiapoptóticos de la familia BCL2, con buena estabilidad química, plasmática y microsomal, además de un proceso de producción escalable, anticipamos que tendrá una amplia utilidad clínica para atacar las CSC humanas inactivas resistentes a la apoptosis en una serie de células recalcitrantes. neoplasias malignas como se presenta en nuestro reciente artículo principal (Goff D et al, Cell Stem Cell. 7 de marzo de 2013;12(3):316-28). Se logró un progreso significativo en los hitos del segundo año y hemos logrado avances tempranos en varios hitos proyectados para el año 3. La secuenciación completa del ARN transcriptoma, la matriz qRT-PCR y el análisis qRT-PCR específico de isoformas de empalme realizados en progenitores purificados por FACS derivados de 8 muestras CP, 8 BC y 6 normales demostraron que el cambio de isoformas de empalme favorece la expresión de isoformas largas pro-supervivencia durante la progresión de CP a blast BC CML y en CSC injertados en el nicho de la médula ósea (BM). Tanto la expresión de las proteínas BCL2 como MCL1 humanas se co-localizaron con células CD34+ leucémicas humanas injertadas en la epífisis de la médula ósea y sirvieron como importantes biomarcadores de respuesta al sabutoclax. Es importante destacar que el tratamiento intravenoso con sabutoclax redujo la supervivencia de BC CML CSC en nichos de médula y esplénico en dosis que preservaron las células madre hematopoyéticas normales en modelos de xenoinjerto RAG2-/-gamma c-/- establecidos con células CD34+ de sangre de cordón umbilical. Mientras que el tratamiento con dasatinib solo aumentó el CSC de CML BC inactivo trasplantable en serie en BM, sabutoclax disminuyó la supervivencia de CSC de manera proporcional con la regulación positiva de las isoformas proapoptóticas cortas y la regulación negativa de las isoformas antiapopoptóticas largas de la familia BCL2. Si bien los estudios anteriores involucraron la administración intraperitoneal, en los últimos 12 meses nos hemos centrado en un programa de administración intravenosa (IV) clínicamente más relevante con sabutoclax IV administrado solo o en combinación con dasatinib oral. En estos estudios, sabutoclax sensibilizó las CSC inactivas a dasatinib, lo que resultó en una disminución significativa en la supervivencia de las CSC en comparación con dasatinib solo. Además, los ratones trasplantados en serie con células humanas de ratones tratados con una combinación tuvieron una mayor supervivencia en comparación con los trasplantes en serie de tejidos tratados con un solo agente. Las células CD34+ humanas de la médula ósea de ratones tratados con combinación tenían más células en ciclo que las células CD34+ en comparación con la médula ósea de ratones tratados con dasatinib solo. La frecuencia de CD34+BCL2+ y CD34+MCL1+ BC CSC fue significativamente menor en BM tratado con una combinación de sabutoclax y dasatinib, lo que sugiere que la combinación actúa sinérgicamente para disminuir la supervivencia de CSC y aumentar la vida útil de los ratones injertados con CSC. Durante este período de 12 meses, dos CMO distintas, Syncom y Norac, ampliaron con éxito la producción de sabutoclax. El Dr. Pellecchia (SBMRI) proporcionó sabutoclax purificado por cromatografía flash al Dr. Jamieson para su uso en estudios celulares e in vivo, además de realizar análisis de control de calidad (integridad y pureza) en formulaciones ampliadas de sabutoclax producidas por Norac (4 g) y Syncom (30 g) en diferentes vehículos. En estudios de formulación se desarrolló y calificó un método de cromatografía flash que separa impurezas y compuestos de degradación del sabutoclax. Se realizaron estudios adicionales de solubilidad y estabilidad para identificar una formulación IV de Solutol, en comparación con la formulación IP anterior DMSO/PBS Tween, que podría usarse tanto para estudios preclínicos como para ensayos clínicos futuros. Se realizaron estudios piloto de farmacocinética en ratones y ratas con sabutoclax formulado con Solutol y mostraron una pérdida de peso asociada con impurezas que podían eliminarse fácilmente mediante cromatografía flash estándar. Como resultado, la producción de ssabutoclax incluirá cromatografía ultrarrápida para mejorar la pureza y la estabilidad y este material se utilizará para estudios adicionales de PK y PD. En conclusión, estamos en camino de lograr nuestros hitos según lo establecido en la subvención y anticipamos que sabutoclax formará la base de estudios clínicos combinados destinados a erradicar el CSC inactivo en una amplia gama de neoplasias malignas refractarias.

Investigaciones recientes con células madre cancerosas realizadas por nosotros mismos y por otros han reforzado el interés en la expresión e inhibición de los miembros de la familia BCL2 en la leucemia mieloide crónica (LMC), la leucemia mieloide aguda (LMA) y el cáncer de mama (Goff DJ et al Cell Stem Cell 2013; Lagadinou ED et al. al Cell Stem Cell 2013; Vaillant F et al Cancer Cell 2013). La sobreexpresión de genes de la familia BCL2 que favorecen la supervivencia se ha relacionado con la resistencia terapéutica impulsada por CSC latentes y autorrenovables. Por tanto, la familia BCL2 representa un objetivo terapéutico atractivo que puede ofrecer el potencial de reducir las tasas de recaída. Debido a la mayor propensión al empalme alternativo en humanos en comparación con ratones, nuestra investigación financiada por CIRM ETll se ha centrado en la secuenciación del ARN del transcriptoma completo, qRT-PCR específica de isoformas de empalme y análisis de matriz de PCR BCL2 de CSC purificadas con FACS de pacientes con leucemia mieloide crónica y derivados de CSC. de crisis de explosión humana CML injertado modelos de ratón RAG2-/-gc-/-. Un inhibidor de Pan-BCL2 hace que las células madre de leucemia humana residentes en la médula ósea sean sensibles a la inhibición de la tirosina quinasa. Célula madre celular. 2013 Mar 7;12(3):316-28) apareció en un artículo principal en Cell Stem Cell en marzo. Este estudio también condujo a una serie de revelaciones relacionadas con estrategias únicas de detección de CSC y pronóstico de pacientes basadas en isoformas de empalme de genes de supervivencia y autorrenovación únicas. Como resultado, la focalización en pan BCL2 ha generado un interés considerable por parte de investigadores académicos y farmacéuticos que quisieran adoptar el enfoque de sensibilización de CSC latente a agentes que se dirigen a células en división, incluidos los inhibidores de tirosina quinasa, la quimioterapia y la radioterapia.