Optimización de técnicas de derivación de células madre embrionarias humanas y producción/distribución de líneas de grado GMP

El objetivo de nuestro trabajo es derivar nuevas líneas de células madre embrionarias humanas para distribuirlas a los investigadores de células madre. Durante el año pasado, produjimos 11 nuevas líneas que creemos que serán herramientas valiosas para todas las fases del trabajo hacia las terapias de medicina regenerativa, incluidas las aplicaciones clínicas tempranas, de descubrimiento y traslacionales. En el camino, este trabajo nos está enseñando mucho sobre el desarrollo embrionario temprano y los procesos especializados que distinguen los pasos críticos en humanos en comparación con los modelos animales. ¿Cuál es el origen de los embriones para nuestras derivaciones? Utilizamos embriones que sobran tras la finalización de tratamientos de fertilidad como la fecundación in vitro. En todos los casos, obtenemos el consentimiento informado por escrito de ambas personas cuyo material reproductivo se utilizó para crear los embriones. Además, los investigadores de nuestro grupo no tienen contacto directo con la pareja que realiza la donación. Este proceso está a cargo del Gamete and Embryo Bank de la Universidad de California en San Francisco. Es importante tener en cuenta que, de lo contrario, los embriones que utilizamos serían destruidos, un punto que a veces se pasa por alto. ¿Cuáles son los métodos que utilizamos para derivar estas nuevas líneas de células madre embrionarias humanas? El trabajo que se llevó a cabo en los últimos 12 meses empleó dos técnicas. Una línea se obtuvo utilizando métodos estándar que se han empleado durante muchos años para producir líneas de células madre en muchas especies, incluidos los humanos. En general, los embriones humanos en etapa temprana se descongelan y se cultivan durante unos días en el laboratorio hasta que emerge un grupo de células muy compactas, denominadas colonias de células madre embrionarias humanas. Los investigadores de células madre pueden detectar estas células especiales basándose en su apariencia al microscopio. La ventaja de esta técnica es que es un método sencillo para producir de forma fiable líneas de células madre embrionarias humanas. La desventaja es que los progenitores que buscamos están expuestos durante períodos prolongados a otros tipos de células en el cultivo, lo que podría afectar su composición genética y, posteriormente, su potencial de desarrollo. En consecuencia, utilizamos un método diferente para derivar las otras diez líneas de células madre embrionarias que produjimos durante este período de subvención. El enfoque general fue cultivar embriones humanos donados de una sola pareja hasta que contuvieran entre 8 y 12 células. Luego utilizamos equipo especializado para extraer células individuales de cinco embriones hermanos. Se permitió que cada célula se desarrollara de forma aislada. Cuatro células de un embrión dieron lugar a líneas celulares, al igual que tres células de otro embrión. Los tres embriones restantes produjeron cada uno una línea celular. Este conjunto único de líneas permitirá a los investigadores de células madre comprender el papel que desempeña la genética a la hora de especificar las características básicas de las células madre embrionarias humanas en comparación con las señales ambientales que se transmiten inevitablemente a medida que las líneas se propagan en el laboratorio. También estamos interesados ​​en el concepto de que las células individuales que se extraen de embriones en etapas muy tempranas, que no han recibido señales de otros tipos de células que se encuentran en etapas posteriores de desarrollo, tienen más probabilidades de ser verdaderamente pluripotentes, como lo demuestran sus características genéticas y firmas moleculares. ¿Por qué necesitamos líneas adicionales de células madre embrionarias humanas? Muchas de las células madre más utilizadas llevan muchos años en cultivo. Esto crea varios problemas. En primer lugar, el largo período de tiempo que las células madre embrionarias humanas más comúnmente estudiadas han estado en cultivo significa que es probable que hayan acumulado errores que son el resultado de errores cometidos durante el proceso de autorrenovación. Esto es aún más probable porque todavía no conocemos las condiciones óptimas para el cultivo de las células en el laboratorio. En consecuencia, los estudios en curso en muchos grupos, incluido el nuestro, están diseñados para mejorar el entorno para el mantenimiento de células madre embrionarias humanas, lo que creemos que mejorará la fidelidad con la que hacen copias de sí mismas. En segundo lugar, casi todas las líneas existentes han estado expuestas a productos animales, lo que plantea la posibilidad de que contengan vectores de enfermedades. Por esta razón, la Administración de Alimentos y Medicamentos hace que sea difícil (pero no imposible) que las terapias basadas en células que se utilizan en aplicaciones clínicas sean aprobadas una vez que hayan experimentado este tipo de exposiciones. Por lo tanto, todo nuestro trabajo de derivación ha empleado únicamente reactivos humanos, lo que creemos que agilizará su aprobación para su uso en aplicaciones clínicas.

Nuestro objetivo es derivar líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) utilizando métodos nuevos y mejorados. Durante los dos primeros años de este proyecto, produjimos once nuevas líneas de hESC. Una línea se derivó de un embrión humano intacto de seis días de edad que consta de 50 a 100 células. Casi todas las hESC existentes se derivaron utilizando este enfoque. Las otras diez líneas se derivaron utilizando un nuevo método en el que ayudamos a ser pioneros. Esta técnica consiste en extraer una sola célula de un embrión humano en una etapa anterior que se compone de 8 células. En las condiciones adecuadas de laboratorio, la célula hace copias de sí misma, un proceso que produce una línea hESC. La ventaja de este método sobre el enfoque más convencional es que sabemos cuándo se eliminó la célula fundadora y de dónde vino. Además, el fundador está aislado de las señales de otras células embrionarias, lo que podría borrar aspectos del estado de las células madre. Finalmente, derivamos múltiples líneas de embriones individuales para que los subconjuntos de líneas tengan la misma composición genética, lo que permitirá a los científicos estudiar la influencia del medio ambiente en las propiedades básicas de las células madre. Durante el período de subvención actual, registramos las células en el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM). El proceso implicó la presentación de la documentación que incluye la prueba de que las parejas que donaron embriones a este proyecto dieron su consentimiento informado. También describimos las condiciones que utilizamos para derivar y propagar estas células. En general, nuestros métodos enfatizaron el uso de materiales humanos, lo que evita la exposición a productos animales que podrían estar contaminados con agentes infecciosos. Estas células ahora están disponibles para que las utilicen los investigadores del CIRM y otros científicos que cuentan con fondos de investigación no federales. Este año, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) iniciaron un proceso paralelo para registrar hESC. El objetivo era ampliar en gran medida el número de líneas hESC que a los investigadores se les permitiría utilizar en experimentos financiados con dólares federales. Para que las células que obtuvimos con fondos de CIRM estuvieran más disponibles, intentamos registrar nuestras células en el NIH, lo que requirió la presentación de documentación que era muy similar a la documentación que requería CIRM. La línea derivada por métodos convencionales fue rápidamente aprobada. Sin embargo, las líneas que se derivaron de embriones en etapas anteriores aún no han avanzado en el proceso de aprobación. Hubo dos problemas. La primera fue que el gobierno federal definió una línea hESC como proveniente de un embrión que consta de 50 a 100 células. Nuestras líneas que procedían de embriones humanos de 8 células no cumplían este criterio. En consecuencia, el Gobierno notificó al público su intención de cambiar esta definición. Siguió un período de comentarios, que ya ha finalizado. Sin embargo, las líneas aún no fueron aprobadas. Luego se hizo evidente que se había restablecido una demanda que impugnaba el uso de fondos federales para la investigación de hESC. Por lo tanto, diez de nuestras líneas todavía figuran como pendientes en el Registro Federal y nosotros (y otros investigadores) no podemos solicitar (o utilizar) dólares federales para estudiarlas. Nuestro progreso científico incluyó el establecimiento de un banco de hESC que obtuvimos. El propósito de un banco es almacenar células en una etapa particular para uso futuro. La necesidad de bancos reconoce que las propiedades básicas de las hESC pueden cambiar en función del tiempo que se propagan en el laboratorio. Para almacenar nuestras células, las ampliamos hasta el punto de que pudimos almacenar aproximadamente mil viales que contenían un millón de células cada uno. Todos fueron congelados después de haberse autorreplicado sólo doce veces, lo que reduce la posibilidad de que ocurrieran cambios adversos. De este modo, ahora estamos en condiciones de distribuir nuestras células a otros investigadores que quieran utilizarlas en su trabajo. Es importante destacar que el tamaño del banco garantiza que nosotros y otros investigadores podamos regresar a esta fuente para obtener viales adicionales de las mismas células que se cultivaron durante el mismo período de tiempo. En experimentos adicionales, comparamos las propiedades de las diez líneas derivadas de embriones tempranos con hESC convencionales. En una serie de experimentos, adoptamos un enfoque global en el que analizamos las propiedades fundamentales de las células. Los resultados arrojaron datos que sugerían que las nuevas líneas tenían propiedades únicas. También encontramos que las líneas que se derivaron de diferentes embriones eran más similares que las líneas que provenían del mismo embrión, posible evidencia de que la diferenciación comienza mucho antes durante las etapas iniciales del desarrollo humano de lo que se pensaba anteriormente. Finalmente, preguntamos si las diferencias fundamentales que observamos entre nuestras nuevas líneas y las células convencionales se reflejaban a nivel funcional. Estos experimentos aún están en progreso, pero tenemos evidencia interesante que respalda esta posibilidad. Por ejemplo, encontramos que líneas que provenían del mismo embrión humano en etapa de 8 células diferían en su capacidad de producir los tipos de neuronas que se consideran terapias celulares para la enfermedad de Parkinson.

El objetivo de nuestro proyecto es mejorar los métodos para generar y almacenar células madre embrionarias humanas (hESC), que se derivan de embriones humanos. Dado que el gobierno federal no apoya el trabajo con embriones humanos, esta investigación sería imposible sin los fondos que hemos recibido del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM). Además, nuestro proyecto se ha beneficiado enormemente de las subvenciones para instalaciones del CIRM, que nos proporcionaron los laboratorios no federales especializados que necesitamos para experimentos que emplean embriones humanos. Nuestro proyecto tiene tres Objetivos Específicos. El primero es derivar líneas hESC a partir de embriones humanos intactos que se han cultivado en el laboratorio durante aproximadamente cinco días. Este es el método que se ha utilizado para derivar la inmensa mayoría de las hESC existentes. En estos experimentos, las células destinadas a convertirse en hESC emergen durante varios días. Por lo tanto, se desconocen el origen y el momento precisos. Algunos investigadores piensan que este elemento de aleatoriedad contribuye a las diferencias significativas que se han observado entre las hESC. Hasta la fecha, utilizamos este enfoque para derivar una línea, UCSF-4, que fue aprobada por CIRM. Así, otros beneficiarios de esta agencia podrán trabajar con estas células. Dado que se generaron utilizando técnicas estándar, UCSF-4 fue aprobado por los Institutos Nacionales de Salud. Por lo tanto, los investigadores que cuentan con financiación federal también pueden trabajar con estas células. El segundo objetivo específico propuso un nuevo enfoque para obtener hESC. Queríamos crear líneas a partir de células individuales extraídas de embriones en etapas de desarrollo muy precisas. Hasta ahora nos hemos centrado en la etapa de ocho células, embriones que han sido cultivados durante tres días en el laboratorio. En estos experimentos utilizamos cinco embriones que fueron donados por una sola pareja. En total, establecimos 10 líneas a partir de células individuales. En otras palabras, derivamos múltiples líneas del mismo embrión. Por lo tanto, esta colección es única porque algunas de las líneas son genéticamente idénticas y todas tienen un alto grado de parentesco genético. Esta propiedad especial es importante para los biólogos de células madre, ya que intentamos comprender los cambios que ocurrieron a lo largo del tiempo mientras las células se mantienen en el laboratorio. Además, tenemos evidencia de que las hESC que se derivan de embriones que han crecido durante tres días en lugar de cinco son más plásticas porque pueden formar mejor los precursores de una gama más amplia de tipos de células que componen el cuerpo humano. Al igual que UCSF-4, el CIRM registró las diez líneas derivadas de células individuales extraídas de embriones. También fueron enviados a los Institutos Nacionales de Salud junto con UCSF-4. Sin embargo, se nos notificó que no se ajustan a la definición federal de línea hESC, que especifica la derivación de un embrión que ha sido cultivado durante cinco días en lugar de tres en el laboratorio. Por lo tanto, estas líneas aún están pendientes de aprobación, lo que requerirá cambiar la definición federal. Por lo tanto, no está claro si alguna vez se registrarán, un proceso que permite a los científicos financiados con fondos federales trabajar con líneas hESC. Nuestro tercer objetivo específico era derivar una línea de hESC utilizando buenos procesos de fabricación (GMP) según lo especificado por la Administración de Alimentos y Medicamentos. Estas pautas se han establecido para garantizar que las terapias basadas en células sean seguras para los pacientes. Por ejemplo, están diseñados para prevenir la propagación de agentes infecciosos que pueden contaminar las células animales a los humanos. Un obstáculo para producir células de grado GMP es que la derivación de hESC requiere una alfombra de otro tipo de célula, que se cree que "alimenta" a los embriones con las sustancias necesarias para la generación de colonias de hESC. Por lo tanto, estas células "alimentadoras" también deben producirse utilizando métodos GMP. Para evitar este paso laborioso, hemos desarrollado métodos para el cultivo de hESC "sin alimentación". Planeamos utilizar el mismo enfoque para derivar hESC de embriones intactos. Hasta la fecha, con el apoyo de CIRM, hemos obtenido 11 líneas de hESC. Por lo tanto, la distribución de estas células se ha convertido en una parte importante de este proyecto. Es interesante observar que estas líneas se utilizan para una amplia variedad de experimentos. Por ejemplo, UCSF-4 está siendo estudiado por un consorcio que se formó para comprender cómo las modificaciones químicas de los genes controlan su expresión. Esta es una pregunta particularmente interesante porque los programas que especifican las etapas iniciales del desarrollo humano son muy poco comprendidos. Los otros grupos que utilizan nuestras células se centran en una amplia gama de procesos normales y patológicos. Varios investigadores están estudiando los mecanismos mediante los cuales se desarrollan las células del cerebro y la médula espinal. Un grupo espera utilizarlos como estrategia terapéutica para pacientes con esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Lou Gehrig. Otros investigadores están estudiando la formación del músculo cardíaco, las células beta pancreáticas y el hígado. Por último, nuestras líneas también se utilizan con fines de formación en nuestro Centro Compartido de Investigación y Docencia del CIRM.

El objetivo de nuestro trabajo ha sido derivar nuevas líneas de células madre embrionarias humanas a partir de embriones donados por parejas al finalizar los ciclos de fertilización in vitro. Muchos laboratorios, incluido el nuestro, derivaron líneas utilizando el método que se describió originalmente. Los embriones que se cultivaron durante 5 a 6 días en el laboratorio se transfirieron a un césped de células que sustentaron el eventual crecimiento de células madre embrionarias humanas. Al utilizar métodos estándar para realizar derivaciones, nos sorprendieron las formas en las que pensábamos que este método podría mejorarse. Por ejemplo, las células del embrión que están destinadas a formar la placenta mueren. Por lo tanto, parecía probable que los productos que liberaban pudieran tener influencias adversas sobre las células madre. Además, observamos la formación de tipos de células morfológicamente distintas antes de que finalmente emergieran en medio de ellas "islas" de células madre muy compactas. Especulamos que estas células extrañas también podrían tener efectos indebidos. Finalmente, examinamos, con un aumento muy alto, embriones que crecieron durante 5 a 6 días. Aunque se supone que las células que dan origen a la descendencia son casi equivalentes en esta etapa, vimos que ya no se parecen. Tomamos esto como una posible evidencia de especialización, lo que significa que es posible que ya estén comenzando el camino hacia convertirse en uno de los tipos de células del cuerpo. Por lo tanto, comenzamos a considerar nuevos enfoques para producir células madre embrionarias humanas. En particular, queríamos derivar líneas de células individuales de embriones en etapas más tempranas que podrían ser menos especificadas y más plásticas en términos de su capacidad para diferenciarse en progenie que son difíciles de obtener a partir de líneas de células madre embrionarias humanas convencionales. En experimentos preliminares, trabajamos con otros científicos del sector de la biotecnología para desarrollar métodos para derivar líneas a partir de células individuales (denominadas blastómeros) que se extrajeron de embriones que se cultivaron durante aproximadamente tres días en el laboratorio. Por el trabajo de otros científicos sabíamos que alrededor de esta época los programas genéticos intrínsecos del óvulo se desvanecen y los del embrión comienzan a desarrollarse. Por lo tanto, era muy posible que las líneas de células madre embrionarias humanas derivadas en esta etapa fueran menos especificadas que sus contrapartes, que se establecieron mediante métodos convencionales. Sin embargo, nuestro trabajo inicial demostró que este nuevo enfoque no era muy eficiente. Aunque unos pocos blastómeros formaron líneas, la mayoría no. Por lo tanto, tuvimos que hacer de este un procedimiento más sólido. Tomamos nuestras pistas para mejorar este método de la arquitectura del embrión. En concreto, las células siempre se encuentran agrupadas y nunca se encuentran aisladas. Por lo tanto, para imitar esta disposición, rodeamos cada blastómero con células y proteínas para simular la geometría y el entorno molecular del embrión temprano. El resultado fue un procedimiento de derivación mucho más eficiente. En consecuencia, habíamos desarrollado las herramientas para realizar los experimentos deseados. Para el procedimiento de derivación utilizamos 5 embriones que fueron donados por una sola pareja. A partir de blastómeros individuales extraídos en la etapa de 3 días, derivamos un total de 9 líneas de células madre embrionarias humanas. Por tanto, las líneas eran genéticamente idénticas o estaban relacionadas. En primer lugar, teníamos que demostrar que tenían las características que los investigadores creen que son comunes a todas las células madre embrionarias humanas. Específicamente, expresaron un panel de marcadores que están asociados con este estado. Además, en una placa de laboratorio hicieron descendientes de los 3 linajes que dan origen a todos los tipos de células del cuerpo. La prueba más rigurosa del estado de las células madre es el trasplante a un ratón, donde estas células pueden diferenciarse aún más. Al igual que los derivados por medios convencionales, nuestra colección formó muchas estructuras como huesos, músculos y glándulas. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que tenían las mismas propiedades generales que las células madre embrionarias humanas derivadas de embriones en etapas posteriores. Así, pasamos a la interesante cuestión de si tenían propiedades únicas. Caracterizamos las células a nivel genético, epigenético y funcional. A nivel de genes, comparamos las líneas que se derivaron de una sola célula de un embrión de 3 días con líneas de células madre embrionarias humanas que se derivaron por medios convencionales. Hubo diferencias sorprendentes en los patrones de expresión genética entre los dos. Las marcas epigenéticas decoran el ADN y designan áreas funcionales y no funcionales en términos de expresión genética. Las líneas que se derivaron de células individuales tenían muchas menos de estas modificaciones, lo que sugiere una menor especialización. Finalmente, a nivel funcional, demostramos que un subconjunto de las líneas que produjimos podría formar espontáneamente tipos de células que se encuentran tanto en la descendencia como en la placenta. Dado que estos linajes divergen temprano en el desarrollo, tomamos esto como evidencia de un mayor grado de plasticidad que el asociado con las líneas convencionales. Pensamos que esta propiedad podría ser muy útil para idear terapias de medicina regenerativa.