Nuevo mecanismo de autorrenovación/diferenciación de células madre embrionarias humanas

Los objetivos específicos propuestos en esta solicitud están diseñados para avanzar significativamente nuestra comprensión de la biología de hESC hacia (1) el control epigenético de OCT3/4 y su contribución funcional a la pluripotencia de las células madre, (2) el papel del mecanismo regulador del ciclo celular en las células madre decisión de autorrenovación/diferenciación, y (3) la utilización potencial del mecanismo regulador molecular para futuras terapias regenerativas. Se proponen tres objetivos específicos principales. Objetivo específico 1: Importancia de la regulación molecular mediada por CDK2AP1 en la autorrenovación/diferenciación de hESC. Objetivo específico 2: Análisis de biología de sistemas para identificar vías moleculares clave en la regulación de hESC mediada por CDK2AP1. Objetivo específico 3: Identificación de molécula pequeña activadora de OCT3/4. Estos objetivos se basan en nuestro estudio preliminar utilizando células madre embrionarias de ratón. El objetivo principal de esta propuesta es traducir aún más lo que hemos encontrado con el modelo mESC knockout de Cdk2ap1 a la biología de células madre embrionarias humanas. Reconociendo la diferencia entre el modelo de ratón y el modelo humano, hemos realizado el estudio propuesto en paralelo utilizando nuestro modelo mESC establecido y también generando y probando el modelo hESC. Para el objetivo específico 1 del año 1, hemos detallado más nuestro conocimiento sobre cómo CDK2AP1 regula epigenéticamente el promotor Oct3/4 a nivel molecular. Recientemente hemos realizado un hallazgo novedoso de que CDK2AP1 puede desempeñar un papel en la regulación de Oct3/4 de manera específica de secuencia junto con el complejo NuRD. Esto también se ha confirmado en el modelo hESC. También hemos descubierto que CDK2AP1 puede ejercer su efecto a través de cambios en la localización y conformación celular durante la diferenciación de hESC. Estamos en el proceso de detallar más este mecanismo para vincular la función reguladora del ciclo celular de CDK2AP1 a través de CDK2/RB y la función epigenética en la diferenciación de células madre. Hemos generado las líneas celulares hESC necesarias para realizar aún más los estudios propuestos. Al final del Año 2 como estaba planeado, esperamos enviar un manuscrito relacionado con el Objetivo 1. Se presentará una subvención NIH RO1 para el próximo ciclo relacionado con nuestros nuevos hallazgos. Para el objetivo específico 2, hemos realizado y obtenido una cantidad significativa de datos que mejoran nuestra comprensión sobre el papel molecular de CDK2AP1 en la diferenciación de células madre. Recientemente hemos descubierto que CDK2AP1 altera significativamente la metilación del ADN de vías de señalización clave, especialmente la vía Wnt, que se sabe que tiene un impacto significativo en el mantenimiento y la diferenciación de las células madre. Hemos detallado el eje molecular relacionado con la regulación epigenética de la vía Wnt por CDK2AP1 y se está preparando un manuscrito. Utilizando las líneas celulares hESC que hemos generado, realizaremos un enfoque de biología de sistemas como se propuso en el Año 2. Esto nos permitirá generar una cantidad significativa de datos relacionados con el papel epigenético de CDK2AP1 en la diferenciación de hESC. Para el objetivo específico 3, hemos generado sublíneas de hESC con el promotor-GFP OCT3/4 humano y CDK2AP1-GFP humano para la detección de bibliotecas químicas. Generaremos más mutantes de deleción de las líneas RFP del promotor CDK2AP1 y los probaremos antes de iniciar los trabajos propuestos en el objetivo 3. Iniciaremos el Objetivo 3 propuesto cerca del final del Año 2.

Durante el período que abarca el informe, hemos logrado avances significativos en la investigación hacia (1) el control epigenético mediado por la proteína 2 asociada a la quinasa 1 dependiente de ciclina (CDK2AP1) a través del complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas (NuRD) y su contribución funcional a la pluripotencia de las células madre. (2) Papel de Cdk2ap2, una molécula hermana de Cdk2ap1 en la autorrenovación de las células madre, (3) el papel de CDK2AP1 regulador del ciclo celular en la regulación del promotor OCT4 y (4) vías de señalización molecular de todo el genoma afectadas por CDK2AP1 en ESC . Estos se resumen brevemente a continuación. (1) CDK2AP1 es un nuevo factor regulador en la señalización Wnt mediada por NuRD en células madre embrionarias (manuscrito presentado). El complejo NuRD es necesario para modular la transcripción de genes de pluripotencia esenciales en la autorrenovación de ESC. MBD3 se considera un actor clave en la formación del complejo funcional NuRD. Mostramos que CDK2AP1 desempeña un papel en la autorrenovación/diferenciación de ESC al involucrar MBD3 en la región promotora de genes relacionados con la señalización Wnt. La ocupación de MBD3 en varios promotores del gen de señalización Wnt se perdió significativamente en ausencia de CDK2AP1, lo que resultó en una hiperactivación de la señalización Wnt. Proponemos que la modulación transcripcional de la vía Wnt mediada por MBD3/NuRD requiere la presencia de un componente auxiliar esencial, como CDK2AP1, que puede ayudar a la asociación del complejo con la región focal específica de los promotores objetivo. (2) Cdk2ap2 es un nuevo regulador para la autorrenovación de células madre embrionarias murinas (en prensa). Células madre y desarrollo). Para comprender la función de Cdk2ap2 durante el desarrollo temprano, generamos mESC con alteración homocigótica del locus endógeno de Cdk2ap2 (Cdk2ap2tr/tr). Las mESC Cdk2ap2tr/tr, cuando se cultivaron en un medio de crecimiento completo, mostraron un fenotipo de diferenciación temprana caracterizado por colonias aplanadas y un límite intercelular distinto. También observamos una regulación negativa de Nanog y una regulación positiva en los marcadores de diferenciación del mesodermo y el endodermo. Las mESC Cdk2ap2tr/tr pudieron formar cuerpos embrioides (EB); sin embargo, esos EB no eran saludables y tenían un mayor nivel de apoptosis. Cdk2ap2 en condiciones normales tiene una expresión bifásica, lo que sugiere funciones reguladoras en la diferenciación temprana versus tardía de las células madre. Estos datos comienzan a contribuir a nuestra comprensión de cómo Cdk2ap2 puede estar involucrado en la regulación de la autorrenovación de las células madre durante la embriogénesis temprana. (3) Regulación epigenética de Oct4 por CDK2AP1 (Presentado en la ISSCR 2012, Manuscrito en preparación). Los reguladores del ciclo celular están adquiriendo un papel más destacado; entre ellos se incluyen moléculas como la p27, que se ha demostrado que desempeña un papel en la cinética del ciclo celular para mantener un estado pluripotente y regular genes específicos implicados en la pluripotencia. En nuestros estudios, hemos descubierto que CDK2AP1 desempeña un papel clave en el silenciamiento Oct3/4 mediado por NuRD al regular epigenéticamente el promotor Oct4 durante la diferenciación tanto de mESC como de hESC. El análisis detallado del promotor Oct4 reveló una ausencia de metilación del ADN en la región potenciadora proximal (PE) en mESC Cdk2ap1-/- diferenciadas. Paralelamente, hemos visto un aumento en la acetilación de H3K9 en la misma región en Cdk2ap1-/- mESC. Hemos encontrado ocupación de CDK2AP1 en la región PE en mESC, así como en cuerpos embrioides de hESC. Además, en ESC hemos observado interdependencia en la unión de CDK2AP1 y MBD3 al promotor OCT4. En hESC, la translocación nuclear de CDK2AP1 tras la diferenciación fue distinta de mESC. CDK2AP1 desempeña un papel importante en la diferenciación de células madre mediante asociación con el complejo NuRD en regiones promotoras específicas, cambiando la accesibilidad a la cromatina y provocando el silenciamiento del promotor Oct4 durante la diferenciación en ESC. (4) Firmas epigenéticas globales y vías de señalización afectadas por CDK2AP1 en ESC (Manuscrito en preparación). Para obtener información sobre los efectos moleculares de CDK2AP1 en todo el genoma en la diferenciación de ESC, hemos realizado análisis de biología de sistemas combinando análisis de matriz de metilación de ADN y análisis de matriz de expresión génica en muestras de mESC y hESC. A partir de la metilación del ADN (MeDIP-seq en hESC) y el análisis de la matriz de expresión génica, encontramos que hubo cambios metilómicos y transcripcionales globales debido a la eliminación de las ESC. Los análisis detallados revelaron que la eliminación de Cdk2ap1 provocó cambios de metilación específicos del sitio. Hemos construido un mapa de metared completo de mESC construido a partir de 12 matrices diferentes de expresión genética de ratón para explicar cómo la remodelación y diferenciación de nucleosomas están interconectadas y vinculadas. Además, al utilizar nuestro modelo mESC knockout para Cdk2ap1, hemos demostrado que CDK2AP1 puede afectar el repertorio y la función de los miARN implicados en la autorrenovación/diferenciación de las células madre. Este hallazgo demuestra que CDK2AP1, ya sea a través del mecanismo regulador del ciclo celular o del control transcripcional, puede afectar la función de miRNA en ESC.

Resumen público: durante el período del informe del año 3 (agosto. 1 de julio de 2012-jul. 31, 2013), hemos logrado importantes avances en la investigación hacia (1) el papel epigenético de CDK2AP1 en el mantenimiento/diferenciación de las ESC mediante la regulación de la vía WNT. Este trabajo fue una extensión del año anterior y se completó para una publicación. (2) Hemos realizado análisis bioinformáticos en nuestros propios conjuntos de datos y conjuntos de datos disponibles públicamente para identificar nuevos factores moleculares en la autorrenovación de hESC. Los hallazgos de este estudio se enviaron a Stem Cells y ahora se encuentran en revisión para su publicación. (3) Hemos realizado un análisis detallado para definir el papel molecular de CDK2AP1 y MBD3 en ESC de ratón y humanos, que se resumen brevemente a continuación. (1) CDK2AP1 es un nuevo factor regulador en la señalización Wnt mediada por NuRD en células madre embrionarias (Publicado en JBC 87(49): 41103–41117): como continuación del trabajo del año anterior, hemos completado el estudio y lo hemos revisado con éxito. el manuscrito para su publicación en JBC durante el primer trimestre de este período de informe. Se ha demostrado el papel potencial de MBD3/NuRD en la represión de genes de pluripotencia en ESC. Sin embargo, todavía es difícil de alcanzar el mecanismo molecular detallado, como la necesidad de cualquier factor auxiliar que cebe la formación del complejo o confiera especificidad objetivo. Nuestro estudio aclara aún más el papel epigenético de CDK2AP1 en el mantenimiento de células madre mediante asociación con el complejo MBD3/NuRD y demuestra la importancia de una molécula complementaria de MBD3/NuRD en la regulación de ESC. Un área de interés es cómo se produce el reclutamiento de NuRD en los promotores del gen diana, ya sea focal, ampliamente distribuido o dependiente del patrón del gen. En este estudio, encontramos un nuevo factor regulador dentro del complejo NuRD, que puede funcionar como una guía en el reclutamiento de NuRD para genes WNT específicos para regular la pluripotencia de las células madre. (2) Descubrimiento de nuevos factores moleculares en la autorrenovación de hESC (Manuscrito en revisión: Stem Cells). Nuestra comprensión de la capacidad de autorrenovación y diferenciación de las células madre embrionarias humanas (hESC) sigue siendo difícil de alcanzar en cuanto a los mecanismos moleculares detallados. Se han identificado marcadores moleculares que definen las células madre embrionarias pluripotentes autorrenovables mediante comparaciones relativas entre células diferenciadas y no diferenciadas. La mayoría de los análisis anteriores se han realizado bajo una condición de diferenciación específica que puede presentar cambios moleculares significativamente diferentes a otras condiciones experimentales. Por lo tanto, actualmente no está claro si existen verdaderos marcadores de consenso que definan las hESC indiferenciadas. Nuestro estudio actual aclara la regulación global de las células madre más allá de los factores de células madre bien conocidos mediante la combinación de más de 33 microarrays y las últimas herramientas bioinformáticas. Examinamos si hay un conjunto de genes clave alterados constantemente durante la diferenciación de hESC independientemente de las condiciones de diferenciación. Mediante análisis integrales de microarrays de consenso de todo el genoma, hemos perfilado las firmas de expresión génica que se ven más afectadas por la diferenciación en hESC de nuestros propios conjuntos de datos de microarrays, así como de microarrays disponibles públicamente. Nuestro hallazgo ha revelado nuevos marcadores moleculares que determinan la autorrenovación y forman centros intramodulares. El enfoque bioinformático para la identificación de nuevos marcadores moleculares que definen hESC indiferenciadas, socios que interactúan y análisis de interconectividad puede contribuir a delinear mecanismos moleculares de autorrenovación/diferenciación de células madre y puede ser una herramienta útil para identificar factores moleculares que inducen la potencia de diferentes tipos de células. (3) Identificación de objetivos moleculares que están regulados específicamente por CDK2AP1/MBD3 en mESC y hESC: para examinar el efecto molecular específico de la interacción CDK2AP1/MBD3, restauramos el mutante de unión a Cdk2ap1 wt o Mbd3 en Ckd2ap1 ko mESC y realizamos análisis de microarrays de expresión génica. (Matriz Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0). Además, hemos realizado un análisis ChIP-seq de todo el genoma para identificar objetivos moleculares específicos en hESC que están asociados con CDK2AP1, MBD3, Mi-2beta o histona H3 activa. Se están realizando análisis para perfilar los cambios en las marcas moleculares asociadas con estas moléculas durante la diferenciación de hESC. Los resultados serán esenciales para definir los mecanismos moleculares en la regulación de la autorrenovación/diferenciación de hESC por el complejo MBD3/NuRD.

Resumen público: Hemos realizado análisis adicionales durante el período NCE (1 de agosto de 2013 - 30 de noviembre de 2013) para continuar y finalizar lo que se intentó durante el período de financiación del tercer año. El siguiente es el resumen de los resultados de la investigación durante el período NCE. Para definir firmas moleculares que están reguladas por CDK3AP2, ya sea en asociación con MBD1 o independientemente de MBD3, hemos aprovechado nuestro sistema modelo ESC. Hemos generado líneas mESC a partir de células Cdk3ap2-/- restaurando la forma salvaje Cdk1ap2 o la forma mutante de unión a MBD1 de Cdk3ap2. Luego realizamos análisis de microarrays de expresión génica. Durante este período de NCE, hemos completado el análisis bioinformático de los datos como se presenta brevemente en el informe de progreso. Desde este enfoque, pudimos identificar diferencias significativas en las funciones moleculares de CDK1AP2 y MBD1. Algunas de las vías importantes están reguladas en colaboración por CDK3AP2 y MBD1. Además, encontramos algunas funciones celulares importantes que están reguladas de manera distintiva por CDK3AP2 o MBD1. Este resultado demuestra que CDK3AP2 puede participar en la regulación de ciertos genes mediante la interacción con MBD1/NuRD, mientras mantiene su propio papel molecular aparte del complejo NuRD. Continuaremos definiendo aún más la importancia de estas funciones moleculares en la biología de las ESC y también su importancia in vivo en el desarrollo. Como una forma de definir objetivos moleculares que están específicamente asociados con CDK3AP2/MBD1-NuRD en hESC, hemos realizado el análisis ChIP-seq de todo el genoma con hESC diferenciadas y no diferenciadas. Hemos identificado marcas moleculares que asocian CDK3AP2, MBD1, Mi-3beta o histona activa H2 y examinamos cómo esas marcas cambian durante la diferenciación de hESC en cuerpos embrioides. Este análisis nos permitió perfilar objetivos genéticos que están bajo la regulación de MBD3/NuRD durante la diferenciación de hESC y también objetivos de control de MBD3/NuRD mediado por CDK2AP1. Los resultados de este análisis sentarán las bases para análisis adicionales hacia la definición de los mecanismos moleculares subyacentes a la selección de objetivos o la especificidad de la regulación epigenética por MBD3/NuRD en hESC. Como enfoque adicional para definir el papel de CDK3AP2/MBD1/NuRD en la diferenciación neuronal de hESC, establecimos un modelo de inducción neuronal a partir de hESC y realizamos análisis de expresión génica y ChIP-seq. Actualmente estamos en el proceso de analizar los datos y planeamos continuar más allá del período de financiación. Nuestro objetivo final de este enfoque es definir el papel de CDK3AP2 para conferir especificidad molecular en la regulación espacial o temporal por MBD1/NuRD en ESC y durante el desarrollo.