Se prevé que el uso de células madre como herramienta terapéutica revolucionará muchos campos médicos, como el reemplazo de tejidos para daños asociados a traumatismos y enfermedades relacionadas con el envejecimiento, y la llegada de células madre pluripotentes inducidas (iPS) que se derivan de células somáticas ha generó grandes esperanzas para la terapia celular compatible con el paciente. Sin embargo, el principal obstáculo para el uso rutinario de células iPS para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas es la ineficiencia con la que se generan. Esto se debe en gran medida a que las iPS se producen de forma asincrónica, relativamente lenta y con baja frecuencia. La comprensión de los mecanismos de reprogramación nuclear de fibroblastos humanos somáticos en células pluripotentes que podrían conducir a mejorar la tasa y frecuencia de la reprogramación es de gran interés fundamental y traslacional.
Nuestro enfoque se basa en nuestra amplia experiencia durante las últimas dos décadas utilizando la fusión celular (heterocariones) para comprender los principios inherentes a la conversión del destino de una célula en otra. En estos heterocariones no hay división celular ni fusión nuclear, lo que garantiza que no hay pérdida de material genético, y la reprogramación se produce en presencia del proteoma completo. Específicamente, hemos aplicado este poderoso proceso para estudiar la reprogramación nuclear de células somáticas hacia la potencia e identificar un actor clave en la reprogramación hacia la potencia. La clave de este enfoque son las diferencias de especies entre las células fusionadas que permiten distinguir los productos genéticos de los núcleos "reprogramador" (el inductor) y "reprogramado" (el respondedor). Específicamente, hemos creado heterocariones interespecies entre células ES de ratón y fibroblastos humanos para investigar la conversión de la célula humana somática en una célula madre humana pluripotente. Analizamos los patrones genéticos de las células fusionadas de ratón humano aisladas individualmente mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos de especie, y observamos que más del 70% de los núcleos humanos expresaban los genes Oct4 y Nanog. Además, el proceso de reprogramación es rápido, ya que se detecta 24 horas después de la fusión. Paralelamente, nos centramos en las modificaciones epigenéticas inducidas después de la fusión en los heterocariones, en particular en el estado de metilación del ADN de los promotores de los genes de tallo Oct4 y Nanog. Existe amplia evidencia de que los genes transcritos activamente exhiben niveles muy bajos de metilación en motivos CpG, mientras que los genes reprimidos muestran niveles más altos de metilación. Curiosamente, observamos que ambos promotores, Oct4 y Nanog, se desmetilaron en el núcleo humano, ya 24 horas después de la fusión. A continuación, intentamos dilucidar el papel potencial de una enzima clave que recientemente ha sido implicada en la desmetilación del ADN en el pez cebra. Realizamos un análisis en profundidad del papel de la citidina desaminasa inducida por activación (AID) mediante enfoques de pérdida y ganancia de función. Primero, analizamos los niveles de expresión de AID en los fibroblastos humanos y en las células ES de ratón y detectamos cantidades significativas de AID en ambos tipos de células, lo que respalda nuestra suposición de que la AID es importante para la reprogramación. A continuación, diseñamos un conjunto de ARNip para examinar directamente la función de AID en los pasos iniciales de reprogramación en los heterocariones y demostramos que la eliminación de AID se correlacionaba con la inhibición de la expresión de Nanog y Oct4. Además, monitoreamos el estado de metilación del ADN de sus respectivos promotores y descubrimos que la inhibición de la proteína AID coincide con una disminución en la desmetilación del ADN de los promotores Oct4 y Nanog. Finalmente, para demostrar que la AID per se está implicada en la inhibición de los genes de pluripotencia, reintrodujimos la proteína AID en células inactivadas mediadas por ARNip y demostramos que los niveles de Oct4 y Nanog aumentaron y que la metilación del ADN se revierte. .
En conclusión, durante el primer año de financiación, nuestros resultados demostraron que la reprogramación hacia la pluripotencia en heterocariones es rápida y eficiente e implica una desmetilación activa del ADN, ya que no hay división celular ni replicación del ADN. Además, demostramos que la enzima AID, conocida por su papel en la generación de diversidad de anticuerpos en las células B, es un componente clave para la reprogramación hacia la potencia. Ahora estamos explorando la capacidad de AID para acelerar la generación de iPS. Además, estamos utilizando el sistema heterocarion para identificar y probar otros reguladores tempranos mediante el estudio de los cambios en la expresión genética a nivel global.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) pueden producirse a partir de prácticamente cualquier célula somática mediante la sobreexpresión de unos pocos factores de transcripción, un proceso denominado "reprogramación nuclear". Sin embargo, la generación de iPS es lenta (2 semanas) y la frecuencia de células somáticas que se reprograman con éxito es muy baja (0.1-1%). En la actualidad, los mecanismos moleculares que subyacen a la reprogramación no se comprenden bien. Esto se debe en gran parte a la incapacidad de analizar las primeras etapas de reprogramación a nivel molecular en poblaciones que son heterogéneas o donde el número de células es limitante. Nuestra hipótesis es que la ineficiencia de la reprogramación a iPS se debe a reguladores moleculares aún no identificados o vías críticas para el inicio temprano de la reprogramación. Para estudiar los mecanismos moleculares de la reprogramación se necesitaba un sistema experimental diferente; uno con un inicio rápido y altamente eficiente de reprogramación. Nuestra investigación anterior (Bhutani et al, Nature 2010) mostró el desarrollo de un enfoque de reprogramación rápida, sincrónico y de alta eficiencia que consiste en heterocariones (células fusionadas multinucleadas entre especies). En estas células multinucleadas, la activación de genes de pluripotencia humana como Oct4 y Nanog se produce de forma rápida (24 horas) y eficiente (70% de los heterocariones individuales). Durante el primer año de financiación, nuestros resultados demostraron que la reprogramación hacia la pluripotencia en heterocariones es rápida y eficiente e implica una desmetilación activa del ADN, ya que no hay división celular ni replicación del ADN. Además, demostramos que la enzima AID, conocida por su papel en la generación de diversidad de anticuerpos en las células B, es un componente clave para reprogramar las células somáticas humanas hacia la pluripotencia. Ahora, durante nuestro segundo año de financiación, estamos probando tanto el requisito de AID para la generación de iPS como también la capacidad de AID para acelerar la generación de iPS. También razonamos que la secuenciación global de ARN de heterocariones nos proporcionaría más información sobre el proceso de reprogramación temprana y estamos utilizando el sistema de heterocariones para identificar y probar otros reguladores tempranos mediante el estudio de los cambios en la expresión genética en todo el genoma. Ahora contamos con metodologías optimizadas que nos permiten lograr este objetivo y hemos realizado una secuenciación de ARN global a las 6 horas, el día 1, el día 2 y el día 3 después de la formación del heterocarión. Ahora estamos comenzando a analizar genes activados tempranamente, ya sea relacionados con factores de transcripción asociados a la red de pluripotencia o modificadores epigenéticos. Más específicamente, estamos interesados en enzimas que participan en la desmetilación del ADN y que están en el proceso final de validación de AID en la generación de iPS. La velocidad y eficiencia de la reprogramación en el sistema heterocarión proporciona un medio para identificar factores de transcripción críticos y vías celulares involucradas en la reprogramación temprana. Nuestra investigación con heterocariones permite conocimientos mecanicistas sobre el proceso de reprogramación nuclear que no es posible identificar utilizando iPS.
Período de información:
Año 3 y NCE
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) pueden producirse a partir de prácticamente cualquier célula somática mediante la sobreexpresión de unos pocos factores de transcripción, un proceso denominado "reprogramación nuclear". Sin embargo, la generación de iPS es lenta (2 semanas) y la frecuencia de células somáticas que se reprograman con éxito es muy baja (0.1-1%). En la actualidad, los mecanismos moleculares que subyacen a la reprogramación no se comprenden bien. Esto se debe en gran parte a la incapacidad de analizar las primeras etapas de reprogramación a nivel molecular en poblaciones que son heterogéneas o donde el número de células es limitante. Nuestra hipótesis es que la ineficiencia de la reprogramación a iPS se debe a reguladores moleculares aún no identificados o vías críticas para el inicio temprano de la reprogramación. Para estudiar los mecanismos moleculares de la reprogramación se necesitaba un sistema experimental diferente; uno con un inicio rápido y altamente eficiente de reprogramación. Nuestra investigación anterior (Bhutani et al, Nature 2010) mostró el desarrollo de un enfoque de reprogramación rápida, sincrónico y de alta eficiencia que consiste en heterocariones (células fusionadas multinucleadas entre especies). En estas células multinucleadas, la activación de genes de pluripotencia humana como Oct4 y Nanog se produce de forma rápida (24 horas) y eficiente (70% de los heterocariones individuales). Durante el primer año de financiación, nuestros resultados demostraron que la reprogramación hacia la pluripotencia en heterocariones es rápida y eficiente e implica una desmetilación activa del ADN, ya que no hay división celular ni replicación del ADN. Además, demostramos que la enzima AID, conocida por su papel en la generación de diversidad de anticuerpos en las células B, es un componente clave para reprogramar las células somáticas humanas hacia la pluripotencia. Ahora, durante nuestro tercer año de financiamiento, ambos hemos demostrado el requisito de la AID para la generación de iPS, pero también la capacidad de la AID para aumentar la generación de iPS aproximadamente al doble. Además, debido a que habíamos razonado que la secuenciación global de ARN de heterocariones nos proporcionaría más información sobre el proceso de reprogramación temprana, ahora tenemos metodologías optimizadas que nos permiten lograr este objetivo y hemos realizado una secuenciación global de ARN a las 6 horas, día 1. Día 2 y día 3 después de la formación de heterocarión. A través de este análisis, ahora hemos identificado un factor secretado identificado mediante secuenciación de ARN en Heterokaryons que puede sustituir a uno de los factores clave de reprogramación de iPS, c-myc. La sustitución de myc por un factor secretado permite la generación de células iPS derivadas del paciente más seguras al aliviar la necesidad de integración viral del potente oncogén c-myc. En resumen, la velocidad y eficiencia de la reprogramación en el sistema heterocarión proporciona un medio para identificar factores de transcripción críticos y vías celulares involucradas en la reprogramación temprana. Nuestra investigación con heterocariones permite conocimientos mecanicistas sobre el proceso de reprogramación nuclear que no es posible identificar utilizando iPS.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Mecanismos moleculares de reprogramación hacia la pluripotencia
Resumen público:
La biología de las células madre y sus aplicaciones a las terapias basadas en células, desde sus inicios hace 30 años, se ha visto obstaculizada por consideraciones inmunológicas de rechazo de células no autólogas en pacientes, así como por preocupaciones éticas. Por lo tanto, la generación de células pluripotentes a partir de las propias células somáticas del paciente ha sido el santo grial de la medicina regenerativa. Se han utilizado diversas técnicas para intentar la "reprogramación" nuclear, incluida la transferencia de núcleos somáticos a ovocitos (SCNT), que condujo a la clonación de la oveja "Dolly". Un avance reciente fue la demostración de Yamanaka y sus colegas de que la introducción de sólo cuatro factores moleculares en los fibroblastos de la piel podría generar células pluripotentes inducidas (células iPS), con un potencial similar al de las células ES en su capacidad para generar todas las capas germinales. Las células iPS tienen un potencial incomparable para las terapias celulares, ya que superan las preocupaciones inmunológicas y éticas, además de proporcionar un medio para obtener modelos de enfermedades celulares de los pacientes como herramientas invaluables para la caracterización de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, antes de que se puedan realizar sus aplicaciones clínicas, es de suma importancia (a) caracterizar la reprogramación de las células iPS a nivel molecular y (b) utilizar esta información para aumentar la eficiencia de la generación de células iPS. Nuestros estudios propuestos aprovechan un novedoso sistema basado en fusión celular que hemos desarrollado, en el que la reprogramación se inicia de forma rápida y eficiente. Estos estudios son de fundamental importancia para aumentar nuestra comprensión sobre cómo dirigir y mantener el destino celular. Además, beneficiarán la producción de células iPS y harán avanzar todo el campo de la medicina regenerativa.
Declaración de beneficio para California:
El estado de California es pionero en la investigación de células madre, habiendo reunido no sólo inversiones privadas, como lo demuestran las numerosas empresas de biotecnología que están desarrollando herramientas innovadoras, sino también importantes fondos públicos a través de la Proposición 71, que permite al estado, a través de CIRM Patrocinar la investigación con células madre en instituciones públicas y privadas. Para preservar su posición de liderazgo y fomentar la investigación sobre células madre, el CIRM convoca propuestas de investigación que podrían conducir a avances significativos o al desarrollo de tecnologías útiles para estudiar células madre con el fin de mejorar la salud humana. Proponemos aquí desarrollar una plataforma que mejorará nuestra comprensión de la biología básica de las células madre y establecerá una comprensión molecular del fenómeno de la generación de células iPS, un avance que ha arrasado en el mundo de las células madre en los últimos años. California tiene la suerte de albergar el laboratorio de Shinya Yamanaka, quien fue pionero en esta técnica. Sin embargo, el estudio de la pluripotencia es un campo en su infancia y una mejor comprensión de la biología de las células iPS, especialmente de los eventos moleculares que permiten que una célula de la piel de cualquier ser humano se convierta en una célula iPS (similar a una célula madre embrionaria en su potencial) es muy necesario antes de que se pueda aprovechar plenamente el potencial de las células iPS. Nuestros estudios propuestos se basan en un uso innovador de la fusión celular para estudiar la reprogramación como un enfoque complementario de las células iPS con el objetivo de mejorar nuestra comprensión del proceso de reprogramación nuclear de las células iPS y hacer que su derivación sea mucho más eficiente. Estos estudios contribuirán sustancialmente a todo tipo de investigación con células madre, incluidas las células madre embrionarias humanas y las células madre pluripotentes inducidas, que harán avanzar todo el campo de la medicina regenerativa.
