Mecanismos moleculares que gobiernan la autorrenovación y la pluripotencia de las células hESC e iPS

El principal obstáculo para llevar la medicina regenerativa a la clínica es que las células madre tienen la capacidad de causar tumores y, en la mayoría de los casos, actualmente carecemos de métodos para hacerlas seguras. Es casi seguro que dos de las células madre más prometedoras para la medicina regenerativa, las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS), causarán cáncer en humanos si se trasplantan. La realidad es que si no podemos demostrar que las células madre son seguras y no causan tumores, nunca se utilizarán en pacientes. En el primer año de nuestra investigación, hemos logrado avances sustanciales para abordar este problema al estudiar por qué las células hESC y iPS causan tumores, centrándonos en el papel del protooncogén Myc y buscando nuevos reguladores madre que sean seguros. En este tiempo hemos tenido cuatro publicaciones y otra está en revisión. Myc es único entre los reguladores de células madre porque no sólo desempeña funciones clave en las funciones normales y positivas de muchas células madre, sino que también, cuando se encuentra en exceso, es uno de los genes causantes de cáncer más potentes en humanos. Durante el primer año de investigación, hemos logrado avances importantes en la comprensión de cómo funciona Myc en la regulación de la biología de hESC, el objetivo 1 del premio. Para ello hemos adoptado dos enfoques, estudiando la función de Myc en hESC y también en ESC de ratón (mESC). Los mESC son una herramienta poderosa y complementaria al hESC. Tanto en hESC como en mESC hemos descubierto que los genes Myc son esenciales para la pluripotencia normal y la autorrenovación. Los genes Myc codifican proteínas que son factores de transcripción que controlan el comportamiento de hESC mediante la regulación de niveles de otros factores. Hemos descubierto que Myc dirige el metabolismo y la proliferación de las ESC, además de suprimir potentemente su diferenciación, manteniendo de esta manera el estado de sus células madre. En el curso de estos estudios, hemos identificado moléculas y vías específicas aguas abajo de Myc que representan mecanismos candidatos mediante los cuales orquesta la pluripotencia y la autorrenovación. Curiosamente, algunos de estos factores, pero no todos, también actúan en sentido descendente de Myc en los tumores. Por lo tanto, una teoría es que estas moléculas pueden ser la clave para diferenciar la tumorigenicidad de la pluripotencia. En su trabajo como factor de transcripción, Myc se une al ADN de las células madre y regula la estructura y función del ADN mediante un proceso llamado epigenética. Se sabe muy poco sobre cómo Myc regula la epigenética en las células ESC e iPS. En el primer año de este premio, hemos realizado un estudio global preliminar sobre dónde se unen las dos proteínas Myc principales, c-Myc y N-Myc, en el genoma de hESC y los eventos epigenéticos asociados con esa unión utilizando una poderosa metodología llamada genómica funcional. . También hemos realizado estudios bioquímicos de estos eventos epigenéticos con datos preliminares intrigantes. Además, estamos trabajando para investigar la función epigenética de Myc en células iPS humanas. En conjunto, esto supone un progreso sustancial hacia los objetivos del objetivo 2 del premio. Nuestro objetivo en el objetivo 3 es descubrir nuevos reguladores de células madre, ambos factores que regulan positiva y negativamente la autorrenovación y la pluripotencia. Con el objetivo específico de encontrar factores que supriman la biología de las células madre, hemos realizado dos exámenes preliminares basados ​​en células iPS humanas utilizando una herramienta llamada biblioteca de shRNA, que está disponible comercialmente. Si bien todavía estamos optimizando este enfoque de detección, los dos experimentos iniciales nos han brindado información extremadamente valiosa sobre la forma óptima de realizar la detección en el futuro y han demostrado, en principio, que la metodología de detección funciona. Avanzando hacia el objetivo específico de encontrar reguladores positivos de la pluripotencia, descubrimos que la herramienta clave que necesitamos, algo llamado biblioteca retroviral de ADNc de hESC, no existe comercialmente. Por lo tanto, un objetivo crucial es sintetizar esta herramienta nosotros mismos y estamos trabajando activamente en ello. Es probable que esta biblioteca también sea una herramienta extremadamente valiosa para otros investigadores de células madre. Finalmente, también hemos estado empleando una interesante metodología basada en proteómica para detectar factores que puedan sustituir a Myc en la regulación de las células madre, incluidas las células ESC y iPS humanas. El objetivo en esta área es encontrar factores que puedan hacer el trabajo de Myc en la regulación de las células madre pero sin sus propiedades promotoras de tumores. Nuestros estudios basados ​​en proteómica en el primer año del premio han arrojado algunos candidatos preliminares muy interesantes en ESC, incluidos algunos reguladores de pluripotencia importantes y conocidos. Estamos seguros de que en el segundo año del premio seguiremos desarrollando el progreso sustancial que hemos logrado en el primer año, ganando impulso adicional hacia nuestro objetivo de terapias de medicina regenerativa seguras y efectivas basadas en células madre.

Durante el actual período de financiación hemos logrado avances sustanciales hacia el logro de las metas de los tres objetivos específicos de la propuesta. Con respecto al primer objetivo, probar la hipótesis de que Myc regula la autorrenovación y la pluripotencia de las hESC, hemos logrado varios hitos. Hemos creado hESC con pérdida de función de Myc y determinamos un papel clave para Myc endógeno en la regulación de la autorrenovación y la pluripotencia de hESC. También hemos logrado avances sustanciales en el abordaje de los objetivos del segundo objetivo, estudiar la regulación Myc de la epigenética de las células hESC y iPS. Hemos completado con éxito la primera fase de estudios de genómica funcional (chip ChIP) para c-Myc y N-Myc endógenos en hESC, encontrando un sorprendente papel dual para las proteínas Myc en la regulación del estado epigenético de hESC. En el objetivo específico tres, el descubrimiento de nuevos potenciadores y supresores de la formación de iPS humanos, ya hemos logrado dos objetivos clave. En primer lugar, hemos creado la nueva biblioteca de ADNc necesaria para las pruebas de detección y, en segundo lugar, hemos comenzado a realizar pruebas de detección de moduladores de pluripotencia. También hemos encontrado nuevos factores clave de pluripotencia putativos en una nueva prueba proteómica. En conjunto, estos estudios han dado lugar a varias publicaciones clave y demuestran un progreso sustancial después de sólo dos años de financiación.

Durante el año pasado, nuestra investigación ha logrado avances sustanciales. En nuestros esfuerzos por comprender mejor la función del protooncogén Myc en las células ES humanas, hemos identificado un nuevo cofactor clave para Myc en las células madre llamado Miz-1. Myc y Miz-1 tienen funciones genómicas coordinadas de modo que, si bien cada factor puede regular la expresión genética de forma independiente, con frecuencia trabajan juntos. Cuando Myc y Miz-1 cooperan, su función conjunta suele ser reprimir la expresión de genes asociados a la diferenciación, particularmente genes Hox. Estos datos respaldan un nuevo modelo en el que Myc mantiene la pluripotencia en las células ES humanas e induce la pluripotencia en las células iPS trabajando con Miz-1 para mantener desactivados los genes de diferenciación. Los niveles de Myc normalmente disminuyen durante la diferenciación, lo que teorizamos inicia un desencadenante que permite que la diferenciación se desarrolle normalmente. Los altos niveles de Myc, como se observan en el cáncer, pueden impedir permanentemente que los genes de diferenciación contribuyan a la formación del cáncer. También hemos encontrado en nuestros estudios que la unión genómica de Myc y Miz-1 está asociada con estados epigenéticos específicos. Cuando actúan por separado, Myc y Miz-1 se unen y mantienen regiones epigenéticamente activas del genoma, pero, curiosamente, cuando unen el genoma, mantienen un estado epigenético reprimido. En otros estudios hemos identificado un factor novedoso que puede sustituir a Myc en la formación de células iPS y hemos logrado avances sustanciales en la caracterización de su función. Además, hemos identificado nuevos cofactores proteicos de Myc que son específicos de ESC y que arrojan nueva luz sobre cómo funciona Myc para mantener la pluripotencia.

El año pasado, con el apoyo de la financiación del CIRM, logramos avances sustanciales en una serie de áreas relacionadas con las células madre y la medicina regenerativa. Publicamos 6 artículos, incluidos 5 respaldados por CIRM durante este tiempo. Publicamos solo el segundo estudio sobre la metabolómica de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), descubriendo que están casi, pero no completamente, reprogramadas a nivel metabólico para parecerse a las células madre embrionarias (ESC). Algunas diferencias notables entre iPSC y ESC incluyen cómo metabolizaron los azúcares. Este estudio podría tener implicaciones importantes para el desarrollo de nuevos métodos de producción de iPSC y mejorar la seguridad y eficacia clínica de las iPSC. También publicamos un estudio que compara los transcriptomas de iPSC y células cancerosas. Los transcriptomas son el patrón total de ARN transcritos en las células, que pueden contar historias importantes sobre cómo están programadas y funcionando las células. Es importante destacar que las iPSC y las células cancerosas compartieron sorprendentes similitudes en varios aspectos en nuestros hallazgos, incluida la inhibición de la diferenciación y la inducción de programas metabólicos específicos. Sin embargo, fue notable que las iPSC y las células cancerosas también diferían en algunos aspectos importantes, incluida la alta expresión de factores relacionados con la pluripotencia en las iPSC que estaban ausentes en las células cancerosas. También descubrimos que podíamos convertir las células cancerosas para que se comportaran más como iPSC mediante una forma de reprogramación del cáncer que podría tener una importancia sustancial para el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer. En otro estudio publicado, informamos sobre el transcriptoma regulado por Myc y su cofactor GCN5 en células madre neurales. Curiosamente, los genes regulados por Myc y GCN5 se superponían significativamente, lo que respalda la idea de que estos dos factores a menudo trabajan juntos para regular el destino de las células madre neurales. Sin embargo, los dos factores también divergieron de alguna manera, lo que sugiere que también funcionan de forma independiente. Es importante destacar que la eliminación de Myc o de GCN5 de forma independiente y específica en células madre neurales generó fenotipos muy similares en ratones. En cada caso, los ratones tenían cerebros muy pequeños, lo que respalda un modelo en el que Myc y GCN5 cooperan en células madre neurales para impulsar el crecimiento del cerebro.

El año pasado, los esfuerzos financiados por este premio han producido avances sustanciales en varias áreas. Nuestro laboratorio ha publicado ocho artículos que incluyen una serie de hallazgos novedosos. Hemos avanzado en la comprensión de cómo funciona la proteína Myc en las células madre y en las células cancerosas. En parte, este trabajo se ha relacionado con un cofactor Myc importante, aunque poco comprendido, llamado Miz-1. Nuestro laboratorio determinó cómo Miz-1 se une al ADN y descubrió dos nuevas secuencias de motivos de ADN unidas por Miz-1. A través de estos motivos, Miz-1 activa fuertemente la transcripción de genes diana. Ahora estamos tratando de entender cómo este motivo puede estar relacionado con Myc. También estamos investigando cómo Myc puede influir en el estado global de metilación del ADN de las células madre embrionarias humanas. También hemos determinado que otros factores actúan de alguna manera como Myc en el sentido de que son oncogenes cuando se sobreexpresan y factores que en niveles normales desempeñan funciones importantes en las células madre pluripotentes humanas. Más específicamente, hemos descubierto que los importantes factores de pluripotencia DPPA2 y DPPA4 también son capaces, cuando se expresan, de provocar la formación de cáncer. Este trabajo publicado este año supone un gran paso adelante en nuestra comprensión de la relación clave entre las células madre y las células cancerosas. También investigamos un factor novedoso llamado variante de histona H3.3 y publicamos dos artículos sobre este factor este año. La histona H3.3 es una molécula fascinante porque nuevamente está relacionada tanto con la función normal de las células madre como con el cáncer. Está mutado en un tumor infantil devastador llamado glioblastoma. Al mismo tiempo, nuestros datos sugieren funciones normales clave para el H3.3 en células madre específicas, incluidas las células madre germinales que dan lugar a óvulos y espermatozoides. Publicamos el primer estudio de eliminación de H3.3 en ratones, que proporcionó una ventana a las funciones normales y relacionadas con el cáncer de H3.3. También hemos estado estudiando cómo las células ES y iPS humanas se comportan in vivo en el cerebro con algunos resultados fascinantes. Nuestros objetivos generales son mejorar el conocimiento sobre las células madre y el cáncer y, al hacerlo, hacer que las terapias de medicina regenerativa basadas en células madre sean más seguras y catalizar el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. El año pasado dimos un gran paso adelante hacia estos objetivos.

Durante el período del informe para este premio, nuestro equipo ha logrado avances sustanciales en los objetivos de esta subvención, como se refleja en cuatro nuevas publicaciones. En un sentido amplio, estos estudios han mejorado la comprensión en este campo de la relación entre la maquinaria molecular del cáncer y las células madre. Por ejemplo, las moléculas clave que regulan los comportamientos normales de las células madre pluripotentes, como la autorrenovación y la pluripotencia, también desempeñan funciones en la tumorigénesis y nuestros estudios han aclarado cómo estos factores reguladores (incluidos la cromatina y los factores epigenéticos Myc y la histona H3.3) funcionan normalmente y en cáncer. Estos estudios tendrán impacto tanto en el campo de las células madre cancerosas como en la creación de terapias de medicina regenerativa basadas en células madre más seguras. Más específicamente, en el objetivo 1, hemos avanzado en la determinación de cómo funcionan H3.3 y Myc en el desarrollo y actúan para controlar la expresión génica a través de estudios genómicos. En el objetivo 2, hemos avanzado en la comprensión de cómo Myc y sus cofactores se unen al genoma para regular los estados epigenéticos y la expresión genética en células madre pluripotentes humanas. En el objetivo 3, hemos definido cómo funcionan los nuevos factores oncogénicos clave relacionados con la pluripotencia, incluidos DPPA4 y DPPA2, a través de estudios genómicos y proteómicos de vanguardia.