Se han logrado grandes avances en la determinación de cómo funcionan las mitocondrias en las células madre embrionarias humanas (hESC) y en las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) en comparación con las células derivadas diferenciadas, como los fibroblastos y las células cancerosas. Se ha asumido sin muchos datos, basándose en gran medida en la apariencia general bajo el microscopio, que las células madre pluripotentes humanas (hPSC) contienen mitocondrias bioenergéticamente inactivas y poco desarrolladas. Por el contrario, las células diferenciadas albergan una red mitocondrial madura, con la fosforilación oxidativa (OXPHOS) como principal fuente de energía. Por lo tanto, el papel de las mitocondrias en la bioenergética de hPSC sigue siendo incierto. En un trabajo recién completado financiado por esta subvención de Biología Básica I del CIRM (RB1-01397), hemos demostrado que las mitocondrias de hPSC tienen complejos respiratorios funcionales que consumen oxígeno, lo que es inconsistente con la noción de que las mitocondrias de hPSC no son funcionales. A pesar de esto, la energía generada en las hPSC se produce principalmente mediante mecanismos independientes de las mitocondrias. Para ayudar a mantener intactas las mitocondrias de las hPSC y la viabilidad celular general, la energía de la glucosa importada se quema en lugar de producirse dentro de las mitocondrias, formando un patrón general inusual de utilización de energía en las hPSC en comparación con las células diferenciadas. Combinados, nuestros datos muestran que las mitocondrias de hPSC son energéticamente funcionales y sugieren un mecanismo clave aún por descubrir que convierte esta forma única de bioenergética de hPSC en producción de energía acoplada al consumo de oxígeno dentro de las mitocondrias durante la diferenciación. Los resultados de este trabajo se encuentran actualmente en proceso de envío para su publicación.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
En los últimos años ha habido informes dispersos sobre la apariencia morfológica subdesarrollada y la localización perinuclear fragmentada de las mitocondrias en células madre embrionarias humanas y de ratón (hESC), y recientemente en células madre pluripotentes inducidas humanas reprogramadas (hiPSC). Basándose principalmente en estas observaciones, numerosos investigadores han sugerido que las mitocondrias son bioenergéticamente inactivas o inactivas en las células madre pluripotentes (PSC). Este punto de vista implica que las mitocondrias de alguna manera comienzan a funcionar generando energía celular en un punto indefinido durante la diferenciación en una placa de cultivo o dentro del tracto reproductivo femenino. Sin embargo, esta conclusión no fue examinada rigurosamente, lo cual es una omisión importante dado que se está prestando mucha atención al potencial de las células madre en la medicina regenerativa y porque, en un nivel fundamental, es importante comprender cómo funcionan las mitocondrias, la respiración y la glucólisis. participar en la producción de energía durante todo el desarrollo de los mamíferos.
Muy sorprendentemente, determinamos que las PSC humanas (tanto hESC como hiPSC) contienen mitocondrias que, si bien parecen subdesarrolladas con una morfología fragmentada y una membrana interna desorganizada, consumen oxígeno activamente sin generar mucho ATP. Nuestros datos muestran que los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondriales están ensamblados y son funcionales y muestran que son cuantitativamente equivalentes en cantidad y potencial funcional a los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Además, las hPSC consumen oxígeno al mismo ritmo que las NHDF, aunque las NHDF tienen una mayor capacidad de consumo de oxígeno que las hPSC, que están en su máximo. Los NHDF también utilizan la cadena de transporte de electrones para generar ATP mediante fosforilación oxidativa (OXPHOS), mientras que las hPSC no lo hacen. Debido a esto, las hPSC dependen de la glucólisis para producir energía. Fundamentalmente, también hemos generado datos que muestran que las hPSC obligadas a generar ATP por OXPHOS para limitar la glucosa y el oxígeno abundante no lo hacen y, en cambio, se estancan en el ciclo celular, a diferencia de las NHDF diferenciadas que se adaptan rápidamente. Esto indica que el patrón de metabolismo en las hPSC está "programado" y es una propiedad única del estado pluripotente, muy parecido a los perfiles epigenéticos y de factores de transcripción únicos que respaldan la "troncalidad" genética. Para mantener la viabilidad mediante el apoyo del potencial de membrana mitocondrial, las hPSC, a diferencia de las NHDF, hidrolizan el ATP glicolítico en el complejo V de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, también llamado ATP sintasa F1F0. De hecho, cuando el factor inhibidor mitocondrial 1 (IF1), un inhibidor natural de la hidrólisis de ATP, se expresa ectópicamente en hPSC, la proliferación de células madre se ralentiza y la viabilidad se ve comprometida. Estos datos sugieren que las hPSC contienen mitocondrias funcionales preparadas para la diferenciación y la exposición a niveles más altos y potencialmente tóxicos de oxígeno en el tracto reproductivo femenino a medida que avanza el desarrollo, en lugar de lo que se suponía que era un cambio en el desarrollo para hacer que las mitocondrias de las PSC se expandieran desproporcionadamente a su capacidad celular total. masa y volverse funcional con diferenciación. Esta forma de metabolismo es similar, aunque distinta en varios aspectos, al metabolismo observado en muchas células cancerosas mediante el conocido efecto Warburg.
También hemos generado datos que muestran que este patrón único de metabolismo de hPSC está al menos parcialmente regulado por la expresión de una proteína específica importada de mitocondrias, codificada nuclearmente, UCP2. Nuestros estudios mecanicistas han generado datos que muestran que UCP2 ayuda a limitar la generación de ATP por OXPHOS en hPSC al inhibir el acceso de piruvato al ciclo de TCA, lo que reduce el consumo de oxígeno y limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Especulamos que este nuevo patrón de metabolismo de células madre pluripotentes también puede regular el potencial de diferenciación de hPSC y posiblemente también proporcione una barrera para limitar la eficiencia de la reprogramación de hiPSC.
Este trabajo, financiado por CIRM RS1-00313, CIRM RB1-01397, CIRM TG2-01169 y por el Centro Eli & Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Investigación de Células Madre de UCLA, está en prensa: Zhang, J., Khvorostov, I. ., Hong, JS, Oktay, Y., Vergnes, L., Nuebel, E., Wahjudi, PN, Setoguchi, K., Wang, G., Do, A., Jung, H.-J., McCaffery, JM, Kurland, IJ, Reue, K., Lee, WNP, Koehler, CM y Teitell, MA UCP2 regula el metabolismo energético y el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes humanas. En prensa, EMBO Journal, 2011
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
En los últimos años ha habido informes dispersos sobre la apariencia morfológica subdesarrollada y la localización perinuclear fragmentada de las mitocondrias en células madre embrionarias humanas y de ratón (hESC), y recientemente en células madre pluripotentes inducidas humanas reprogramadas (hiPSC). Basándose principalmente en estas observaciones, numerosos investigadores han sugerido que las mitocondrias son bioenergéticamente inactivas o inactivas en las células madre pluripotentes (PSC). Este punto de vista implica que las mitocondrias de alguna manera comienzan a funcionar generando energía celular en un punto indefinido durante la diferenciación en una placa de cultivo o dentro del tracto reproductivo femenino. Sin embargo, esta conclusión no fue examinada rigurosamente, lo cual es una omisión importante dado que se está prestando mucha atención al potencial de las células madre en la medicina regenerativa y porque, en un nivel fundamental, es importante comprender cómo funcionan las mitocondrias, la respiración y la glucólisis. participar en la producción de energía durante todo el desarrollo de los mamíferos.
Muy sorprendentemente, determinamos que las PSC humanas (tanto hESC como hiPSC) contienen mitocondrias que, si bien parecen subdesarrolladas con una morfología fragmentada y una membrana interna desorganizada, consumen oxígeno activamente sin generar mucho ATP. Nuestros datos muestran que los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondriales están ensamblados y son funcionales y muestran que son cuantitativamente equivalentes en cantidad y potencial funcional a los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Además, las hPSC consumen oxígeno al mismo ritmo que las NHDF, aunque las NHDF tienen una mayor capacidad de consumo de oxígeno que las hPSC, que están en su máximo. Los NHDF también utilizan la cadena de transporte de electrones para generar ATP mediante fosforilación oxidativa (OXPHOS), mientras que las hPSC no lo hacen. Debido a esto, las hPSC dependen de la glucólisis para producir energía. Fundamentalmente, también hemos generado datos que muestran que las hPSC obligadas a generar ATP por OXPHOS para limitar la glucosa y el oxígeno abundante no lo hacen y, en cambio, se estancan en el ciclo celular, a diferencia de las NHDF diferenciadas que se adaptan rápidamente. Esto indica que el patrón de metabolismo en las hPSC está "programado" y es una propiedad única del estado pluripotente, muy parecido a los perfiles epigenéticos y de factores de transcripción únicos que respaldan la "troncalidad" genética. Para mantener la viabilidad mediante el apoyo del potencial de membrana mitocondrial, las hPSC, a diferencia de las NHDF, hidrolizan el ATP glicolítico en el complejo V de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, también llamado ATP sintasa F1F0. De hecho, cuando el factor inhibidor mitocondrial 1 (IF1), un inhibidor natural de la hidrólisis de ATP, se expresa ectópicamente en hPSC, la proliferación de células madre se ralentiza y la viabilidad se ve comprometida. Estos datos sugieren que las hPSC contienen mitocondrias funcionales preparadas para la diferenciación y la exposición a niveles más altos y potencialmente tóxicos de oxígeno en el tracto reproductivo femenino a medida que avanza el desarrollo, en lugar de lo que se suponía que era un cambio en el desarrollo para hacer que las mitocondrias de las PSC se expandieran desproporcionadamente a su capacidad celular total. masa y volverse funcional con diferenciación. Esta forma de metabolismo es similar, aunque distinta en varios aspectos, al metabolismo observado en muchas células cancerosas mediante el conocido efecto Warburg.
También hemos generado datos que muestran que este patrón único de metabolismo de hPSC está al menos parcialmente regulado por la expresión de una proteína específica importada de mitocondrias, codificada nuclearmente, UCP2. Nuestros estudios mecanicistas han generado datos que muestran que UCP2 ayuda a limitar la generación de ATP por OXPHOS en hPSC al inhibir el acceso de piruvato al ciclo de TCA, lo que reduce el consumo de oxígeno y limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Especulamos que este nuevo patrón de metabolismo de células madre pluripotentes también puede regular el potencial de diferenciación de hPSC y posiblemente también proporcione una barrera para limitar la eficiencia de la reprogramación de hiPSC.
Todo este trabajo y mucho más, financiado por CIRM RS1-00313, CIRM RB1-01397, CIRM TG2-01169 y por el Centro Eli & Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Investigación de Células Madre de UCLA, está publicado o en prensa: Zhang, J., Khvorostov, I., Hong, JS, Oktay, Y., Vergnes, L., Nuebel, E., Wahjudi, PN, Setoguchi, K., Wang, G., Do, A., Jung, H.-J., McCaffery, JM, Kurland, IJ, Reue, K., Lee, WNP, Koehler, CM y Teitell, MA UCP2 regula el metabolismo energético y el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes humanas. EMBO Journal, 30:4860-4873, 2011 (comentario de L Cantley en el mismo número). Zhang, J., Nuebel, E., Wisidagama, DRR, Setoguchi, K., Hong, JS, Van Horn, C. M., Imam, SS, Vergnes, L., Malone, CS, Koehler, CM y Teitell, MA Medición del metabolismo energético en células cultivadas, incluidas células madre pluripotentes humanas y células diferenciadas. Nature Protocols, 7:1068-1085, 2012 Zhang, J., Nuebel, E., Daley, GQ, Koehler, CM y Teitell, MA Metabolismo en la autorrenovación, diferenciación y reprogramación de células madre pluripotentes. Invitado, en revisión, Cell Stem Cell, 2012
Período de información:
NCE
Determinamos que las células madre pluripotentes humanas (PSC; tanto hESC como hiPSC) contienen mitocondrias que, si bien parecen subdesarrolladas con una morfología fragmentada y una membrana interna desorganizada, consumen oxígeno activamente sin generar mucho ATP. Nuestros datos muestran que los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondriales están ensamblados y son funcionales y muestran que son cuantitativamente equivalentes en cantidad y potencial funcional a los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Además, las hPSC consumen oxígeno al mismo ritmo que las NHDF, aunque las NHDF tienen una mayor capacidad de consumo de oxígeno que las hPSC, que están en su máximo. Los NHDF también utilizan la cadena de transporte de electrones para generar ATP mediante fosforilación oxidativa (OXPHOS), mientras que las hPSC no lo hacen. Debido a esto, las hPSC dependen de la glucólisis para producir energía. Fundamentalmente, también hemos generado datos que muestran que las hPSC obligadas a generar ATP por OXPHOS para limitar la glucosa y el oxígeno abundante no lo hacen y, en cambio, se estancan en el ciclo celular, a diferencia de las NHDF diferenciadas que se adaptan rápidamente. Esto indica que el patrón de metabolismo en las hPSC está "programado" y es una propiedad única del estado pluripotente, muy parecido a los perfiles epigenéticos y de factores de transcripción únicos que respaldan la "troncalidad" genética. Para mantener la viabilidad mediante el apoyo del potencial de membrana mitocondrial, las hPSC, a diferencia de las NHDF, hidrolizan el ATP glicolítico en el complejo V de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, también llamado ATP sintasa F1F0. De hecho, cuando el factor inhibidor mitocondrial 1 (IF1), un inhibidor natural de la hidrólisis de ATP, se expresa ectópicamente en hPSC, la proliferación de células madre se ralentiza y la viabilidad se ve comprometida. Estos datos sugieren que las hPSC contienen mitocondrias funcionales preparadas para la diferenciación y la exposición a niveles más altos y potencialmente tóxicos de oxígeno en el tracto reproductivo femenino a medida que avanza el desarrollo, en lugar de lo que se suponía que era un cambio en el desarrollo para hacer que las mitocondrias de las PSC se expandieran desproporcionadamente a su capacidad celular total. masa y volverse funcional con diferenciación. Esta forma de metabolismo es similar, aunque distinta en varios aspectos, al metabolismo observado en muchas células cancerosas mediante el conocido efecto Warburg.
También hemos generado datos que muestran que este patrón único de metabolismo de hPSC está al menos parcialmente regulado por la expresión de una proteína específica importada de mitocondrias, codificada nuclearmente, UCP2. Nuestros estudios mecanicistas han generado datos que muestran que UCP2 ayuda a limitar la generación de ATP por OXPHOS en hPSC al inhibir el acceso de piruvato al ciclo de TCA, lo que reduce el consumo de oxígeno y limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Especulamos que este nuevo patrón de metabolismo de células madre pluripotentes también puede regular el potencial de diferenciación de hPSC y posiblemente también proporcione una barrera para limitar la eficiencia de la reprogramación de hiPSC.
Todo este trabajo y mucho más, financiado por CIRM RS1-00313, CIRM RB1-01397, CIRM TG2-01169 y por el Centro Eli & Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Investigación de Células Madre de UCLA, está publicado o en prensa: Zhang, J., Khvorostov, I., Hong, JS, Oktay, Y., Vergnes, L., Nuebel, E., Wahjudi, PN, Setoguchi, K., Wang, G., Do, A., Jung, H.-J., McCaffery, JM, Kurland, IJ, Reue, K., Lee, WNP, Koehler, CM y Teitell, MA UCP2 regula el metabolismo energético y el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes humanas. EMBO Journal, 30:4860-4873, 2011 (comentario de L Cantley en el mismo número). Zhang, J., Nuebel, E., Wisidagama, DRR, Setoguchi, K., Hong, JS, Van Horn, C. M., Imam, SS, Vergnes, L., Malone, CS, Koehler, CM y Teitell, MA Medición del metabolismo energético en células cultivadas, incluidas células madre pluripotentes humanas y células diferenciadas. Nature Protocols, 7:1068-1085, 2012 Zhang, J., Nuebel, E., Daley, GQ, Koehler, CM y Teitell, MA Metabolismo en la autorrenovación, diferenciación y reprogramación de células madre pluripotentes. Cell Stem Cell, 2:589-595, 2012 Dabir, D., Hasson, SA, Setoguchi, K., Johnson, ME, Wongkongkathep, P., Douglas, CJ, Zimmerman, J., Damoiseaux, R., Teitell, MA y Koehler, CM MitoBloCK-6: una pequeña molécula inhibidora de la translocación de proteínas regulada por redox en las mitocondrias. Célula del Desarrollo, 25:81-92, 2013
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Metabolismo mitocondrial en diferenciación, reprogramación y cáncer de hESC y hiPSC
Resumen público:
La calidad y seguridad de las células madre en el desarrollo de terapias de medicina regenerativa es de suma importancia. Los malos resultados incluyen funcionalidad inadecuada, agotamiento, rechazo inmunológico, desarrollo de cáncer y otros. Estudios recientes respaldan firmemente nuestra hipótesis central de que la función mitocondrial determina la calidad y seguridad de las células madre. Las mitocondrias disfuncionales fomentan el cáncer, la diabetes, la obesidad, la neurodegeneración, la inmunodeficiencia y la miocardiopatía. A diferencia de los enfoques del genoma completo, los obstáculos metodológicos para evaluar las mitocondrias en células madre embrionarias humanas (hESC) y en células madre pluripotentes inducidas humanas reprogramadas (hiPSC) son importantes y las técnicas desarrolladas o adaptadas para células madre son casi inexistentes. Con una subvención inicial del CIRM de 2 años, desarrollamos nuevos enfoques para analizar la respiración (el consumo de oxígeno que impulsa la producción de energía) en hESC en una serie de 4 publicaciones invitadas para la comunidad científica de células madre (www.JoVE.com; 2008). Se encuentra en preparación final un manuscrito que describe la función de las mitocondrias hESC en condiciones bajas de oxígeno (hipoxia), en normoxia (aire ambiental) y durante la diferenciación. También desarrollamos en colaboración inhibidores de moléculas pequeñas de funciones mitocondriales específicas, proporcionando así nuevas herramientas esenciales a la comunidad científica para interrogar la función de las mitocondrias de las células madre. A diferencia de los inhibidores actuales de la función mitocondrial, que generalmente son inespecíficos, irreversibles y tóxicos con el tiempo, nuestros nuevos inhibidores son reversibles, no letales y se dirigen a una variedad de funciones mitocondriales específicas. Estos inhibidores se están sometiendo a continuos estudios de validación y refinamiento molecular para su uso en estudios básicos y potencialmente pueden conducir a conocimientos para su aplicación clínica en enfermedades comunes, como la diabetes y el cáncer. Estos avances constituyen la base de nuestra propuesta actual.
Ahora proponemos dos objetivos principales para abordar cuestiones fundamentales en la biología mitocondrial y la seguridad de las células madre. En el objetivo 1, hemos identificado dos mecanismos candidatos principales para regular la utilización de oxígeno y la producción de energía en las mitocondrias de las células madre. Se sabe que los niveles reducidos de las proteínas que regulan la producción de energía favorecen el desarrollo del cáncer. Determinaremos la funcionalidad de las vías productoras de energía en hESC, hiPSC, mitocondrias de células normales y células cancerosas. En los estudios del objetivo 2, utilizaremos nuestros nuevos inhibidores mitocondriales para determinar qué funciones adicionales son esenciales para obtener células madre seguras para el desarrollo clínico. También nos embarcamos en un protocolo de descubrimiento enfocado, basado en métodos ya establecidos de todo el genoma para células madre, para identificar reguladores clave de la maduración mitocondrial con diferenciación de células madre. Combinados, nuestros estudios se basan en un trabajo exitoso financiado por CIRM para avanzar hacia análisis funcionales de mitocondrias que apoyan la autorrenovación, supervivencia y diferenciación de las células madre, con importantes implicaciones económicas y sociales para las terapias celulares de la nueva era en medicina.
Declaración de beneficio para California:
Nuestra propuesta beneficia al pueblo y al estado de California al agregar nuevos conocimientos esenciales sobre las funciones mitocondriales de las células madre embrionarias humanas (hESC), las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y sus derivados diferenciados de linaje, en apoyo a los pueblos de California y el compromiso de los contribuyentes con las terapias celulares personalizadas. Este nuevo trabajo se basa en una subvención inicial CIRM de dos años de gran éxito, [ELIMINADO], que proporcionó una de las primeras caracterizaciones sistemáticas de las mitocondrias de células madre. Los fondos del CIRM apoyaron 1) cuatro protocolos publicados (www.JoVE.com; 2008) sobre el cultivo de células madre puras y métodos de caracterización de mitocondrias para la comunidad científica, 2) el primer informe de diferencias genómicas de alta resolución entre hESC derivadas de diferentes individuos ( Stem Cells; 2008), y 3) estudios casi completos que caracterizan las capacidades funcionales de las mitocondrias hESC que se están preparando para su publicación. Esta caracterización integral respaldada por CIRM de la función de las mitocondrias de las células madre, y los nuevos estudios basados en mecanismos y descubrimientos en nuestra propuesta actual, ayudarán a guiar a los médicos y científicos a seleccionar las mejores células madre posibles para su investigación y uso. Nuestro trabajo en curso impulsará el desarrollo de terapias en los principales centros académicos de California y brindará información a muchas de las compañías farmacéuticas y de biotecnología de California en la industria de células madre en constante crecimiento, cuyo éxito impulsará la contratación y una mayor prosperidad económica para el estado. Los resultados de estos estudios proporcionarán información adicional a los defensores de los pacientes, especialistas en ética y genetistas médicos para ayudar a seleccionar el curso óptimo para desarrollar y modificar las políticas e infraestructura de uso de células madre en California. Esta propuesta también proporcionará nueva información para los pacientes y sus médicos que puede, en algún momento futuro, afectar la selección de células madre particulares con atributos mitocondriales específicos para tipos específicos de aplicaciones terapéuticas. En resumen, el conocimiento adicional proporcionado por nuestros estudios propuestos sobre los factores mitocondriales que controlan el metabolismo de las células madre y la maduración mitocondrial ayudará a definir e impulsar métodos exitosos de diferenciación de hESC y hiPSC, identificará las hiPSC más completamente reprogramadas desde un punto de vista metabólico y generará células. terapias con riesgo reducido, mayor seguridad y potencial cancerígeno limitado. Si se logra un éxito, se logrará un impacto económico y de salud tangible en California, sus instituciones académicas y compañías biotecnológicas/farmacéuticas, y el resto de la nación, a medida que California y su gente lideren el camino hacia la medicina personalizada para el siglo XXI y más allá.
