Un método para mantener y propagar células ES humanas pluripotentes.

Se puede lograr todo el potencial clínico de la terapia con células ES humanas (hES) cuando se pueden cultivar células hES de manera efectiva mientras se mantiene la pluripotencia total. Nos hemos centrado en desarrollar medios de cultivo de células madre mediante los cuales podamos mantener la pluripotencia de las células ES humanas (hES). Es fundamental determinar y desarrollar medios químicamente definidos que no contengan productos animales ni células alimentadoras para que los medios puedan estandarizarse durante la investigación con células madre y en situaciones clínicas. Un componente proteico recombinante importante que utilizaremos en el desarrollo de medios químicamente definidos es un conjunto de ligandos de señalización de TGF-beta, dominios receptores y antagonistas específicos de ligando. Hemos establecido un nuevo método para generar una variedad diversa de estos ligandos, incluidas BMP, activinas, inhibina y sus ligandos heteroméricos de la clase BMP/Activina. Algunos de estos ligandos heteroméricos poseen sus propiedades de señalización a diferencia de sus homólogos homodiméricos. Estos reactivos incluyen Noggin, BMP2, BMP3, BMP6, GDF6, heterodímero BMP2/6 y sus derivados. Estos reactivos han sido diseñados mediante recombinación quimérica. También se modificaron aún más mediante mutagénesis específica de sitio y mediante ensamblaje heterodimérico combinatorio para crear y modificar la afinidad de unión específica de proteínas a sus contrapartes de unión. Varios de estos reactivos están ahora disponibles como proteína recombinante en cantidad suficiente para la detección a gran escala de la composición de los medios. Para establecer las características funcionales y las combinaciones de cultivos óptimas utilizando estos nuevos reactivos, hemos utilizado una célula hES establecida, H9. Hemos cultivado células H9 en varias composiciones de medios de cultivo que contienen parte del reactivo diseñado y hemos seguido la expresión de varios marcadores de diferenciación para monitorear la pluripotencia de las células hES, y también sus capacidades de guiar la diferenciación y mantener la pluripotencia. Primero hemos examinado el efecto de los reactivos antes mencionados: Noggin, BMP2, BMP3, BMP6, GDF6, heterodímero BMP2/6, mutante BMP3 S28A, en nuestra condición mTeSR de medio de cultivo estándar, que contiene bFGF, para la proliferación y diferenciación de células hES. En estos ensayos, se cultivó la línea celular hES H9 y se añadieron reactivos en concentraciones variables (1-100 ng por ml) durante un período de cultivo de 1-5 días. Los reactivos se agregaron en nuevos medios durante el curso del cultivo celular. Hemos utilizado el cambio morfológico y la presencia de marcadores como medio para seguir la diferenciación. Los marcadores de ectodermo son Nestin, Cdx2; mesodermo por Brachyury, HBZ; Marcadores de endodermo por CXCR4, Sox17, Gata4, HBF4 alfa, Gata6, AFP. Dos BMP tuvieron efectos pronunciados al inducir el endodermo de las células. Hemos seguido analizando la eficiencia utilizando FACS. Hasta el 60% de las células se han convertido en células marcadas con endodermo. Con la disponibilidad de un clasificador de células, evaluamos la pluripotencia mediante tasa de proliferación, morfología, señal fluorescente en las líneas informadoras mediante inspección visual y FACS, luego caracterizamos los factores mediante PCR en tiempo real para marcadores de células madre y cariotipo. Se sabe que una alta concentración de FGF puede suprimir la acción de las BMP, por lo que planeamos repetir los experimentos en medios mTeSR con niveles reducidos de FGF para reevaluar los efectos de las BMP sobre las capacidades de diferenciación celular. Una vez completadas estas pruebas, establecimos un protocolo para realizar estos ensayos de manera de alto rendimiento. Actualmente estamos en el proceso de redacción de este trabajo para su publicación (Valera et al., en preparación). Con miras al desarrollo de medios de cultivo químicamente definidos para mantener la pluripotencia, hemos probado varios reactivos de nueva ingeniería para reemplazar un componente proteico en los medios TeSR. Hemos establecido una combinación de factores proteicos que se sabe que mantienen células hES establecidas sin utilizar productos no humanos, excepto albúmina humana, que incluye factores de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) y un derivado proteico morfogenético óseo conocido como AB2008. A este nuevo medio lo hemos denominado medio CAV. Actualmente estamos en el proceso de redacción de este trabajo para su publicación (Valera et al., en preparación).