Análisis de señalización de quinasa de reprogramación y diferenciación de células iPS.

Resumen público del progreso científico El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha generado mucho entusiasmo porque, al igual que las células madre embrionarias (ES), tienen el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de célula del cuerpo, aunque su derivación es técnicamente sencilla. y no requiere el uso de embriones humanos. Hay tres desafíos relacionados que deben superarse antes de que las células iPS puedan aplicarse a la terapia regenerativa: 1) Identificar métodos que mejoren la eficiencia de la generación de células iPS y la calidad de las células iPS derivadas, 2) determinar si las células iPS pueden funcionar de manera idéntica a las ES células, que siguen siendo el estándar de oro, y 3) identificar métodos que puedan controlar la diferenciación de las células iPS en los tipos de células deseados para la terapia regenerativa. Los métodos actuales para la derivación de células iPS son muy ineficientes: sólo un pequeño porcentaje de cualquier población de células adultas humanas puede desdiferenciarse con éxito a un estado similar a ES. Dirigir la diferenciación de células iPS o ES también es muy ineficiente: en cada método de diferenciación dirigida, sólo un pequeño porcentaje de células se diferencian en el tipo de célula deseado. Por lo tanto, comprender el comportamiento de las células individuales dentro de una población mixta es el nivel de detalle necesario para comprender los procesos que, en última instancia, mejorarán las metodologías utilizadas para su aplicación a la medicina regenerativa. Una nueva tecnología proteómica llamada citometría de masas, desarrollada por el Dr. Scott Tanner, de la Universidad de Toronto, se aplicó recientemente en el laboratorio de Nolan para medir más de 40 (eventualmente 100) parámetros simultáneamente a nivel de una sola célula. La citometría masiva utiliza anticuerpos etiquetados con metales de tierras raras para marcar las células tanto en la superficie como en el interior de la célula, luego vaporiza esas células a 13,000 grados Fahrenheit y cuenta cuántas de cada una de las diferentes etiquetas tenía una célula en el momento de su desaparición. Durante este año, un aspecto crítico de este estudio fue el desarrollo de nuevas herramientas de software para organizar e interpretar los conjuntos de datos de alta dimensión generados por la citometría de masas. Un medio eficaz e informativo para mostrar estos datos multidimensionales fue la aplicación del análisis de progresión de árbol de expansión de eventos normalizados de densidad (análisis SPADE), que crea una representación 2D intuitiva de datos multidimensionales. SPADE recupera la ramificación subyacente y la estructura continua de los datos de citometría de alta dimensión al reconocer las diferencias sutiles entre los fenotipos celulares en un espacio n-dimensional (donde n es el número de marcadores adquiridos) y rastrearlos de manera sencilla. Toda la jerarquía de n dimensiones se visualiza en dos dimensiones como árboles SPADE. Además, el año pasado desarrollamos un análisis "Time-SPADE" en el que los árboles se construyen secuencialmente por punto de tiempo, lo que permite el análisis del curso del tiempo de las poblaciones de células cambiantes que ocurren durante los procesos altamente dinámicos de derivación de células iPS y células ES/iPS. diferenciación. En nuestra continua colaboración con el Dr. Marius Wernig de Stanford, un líder reconocido en biología y metodologías de reprogramación de células iPS, aplicamos citometría de masas y análisis SPADE para estudiar el comportamiento de células individuales durante la reprogramación. Utilizando paneles de anticuerpos específicos marcados con metal que desarrollamos, pudimos rastrear la ruta molecular de la desdiferenciación hasta el estado similar a ES y demostramos que la coexpresión de los cuatro factores de Yamanaka tanto a nivel de ARNm como de proteína es fundamental para una reprogramación exitosa. Para estudiar la diferenciación además de la desdiferenciación, aplicamos citometría de masas y metodologías Time/SPADE para rastrear los comportamientos de células individuales dentro de una muestra completa a medida que se diferencian en tipos de células definidos. Para estos experimentos pudimos rastrear las células ES a medida que sufrían cambios en mesodermo, ectodermo y endodermo, los tres linajes celulares que dan origen a todos nuestros órganos. Estos experimentos sientan las bases para el uso de protocolos para inducir la diferenciación en un tipo de célula específica, como neuronal, hematopoyética, cardíaca y pancreática, como solo algunas de las posibilidades. Estudiar estos procesos a nivel de células individuales con un detalle sin precedentes facilitará nuestra optimización de la derivación y diferenciación de células iPS para la terapia regenerativa humana.

El año pasado, aprovechamos el poder del análisis de células individuales de alta dimensión para mapear las transiciones que ocurren durante la reprogramación de las células iPS, un método novedoso que permite la creación de células madre pluripotentes específicas para cada paciente con un gran potencial para la medicina regenerativa. También hemos mapeado las transiciones que ocurren durante la diferenciación de estas células iPS a tipos de células como las neuronales y cardiovasculares, un paso crítico para su eventual aplicación a terapias de medicina regenerativa. Nuestro mapeo paso a paso de estos procesos largos y de múltiples pasos a nivel de una sola célula revela múltiples puntos de control nuevos que permiten la manipulación y optimización adaptadas a las necesidades terapéuticas específicas de cada paciente.

Nuestra investigación se centra en la reprogramación de células iPS, un método que permite la creación de células madre pluripotentes específicas para cada paciente con gran potencial para la medicina regenerativa. El proceso de reprogramación de células iPS es largo (> 2 semanas) e ineficiente (<1%), y por lo tanto se requiere un análisis del curso del tiempo a nivel de célula única para identificar y caracterizar la población minoritaria de células que se reprograman con éxito. El año pasado, aprovechamos el poder del análisis de células individuales de alta dimensión para mapear las transiciones que ocurren durante la reprogramación celular. Hemos identificado una etapa intermedia clave de la reprogramación celular y hemos aislado y caracterizado esta población intermedia clave. También identificamos una trayectoria de reprogramación no productiva en etapa tardía y caracterizamos los requisitos de señalización celular para una reprogramación exitosa al estado pluripotente. Anticipamos que este trabajo conducirá a protocolos de reprogramación mejorados que produzcan células madre pluripotentes enriquecidas y de mayor calidad para su uso en terapia regenerativa.