Propusimos generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas mediante una técnica libre de virus llamada activación de ARN (ARNa). El ARNa es un mecanismo de regulación genética recientemente identificado mediante el cual el ARN pequeño bicatenario dirigido al promotor, también conocido como ARN activador pequeño (ARNsa), puede inducir la expresión génica. Nuestro enfoque para la derivación de células iPS es mediante la activación simultánea de factores de células madre, incluidos OCT4, NANOG, SOX2 y KLF4, utilizando ARNa. Actualmente nos estamos centrando en el objetivo 1 para detectar ARNsa que puedan activar factores de células madre individuales como se especifica en nuestra propuesta. Para facilitar y acelerar dicho proceso de detección, además del método de detección que propusimos originalmente, es decir, mediante el análisis de expresión de genes endógenos, hemos adaptado tres nuevas estrategias. Incluyen el uso de un sistema informador basado en vectores lentivirales, el uso de una plataforma de reprogramación iPS retroviral de ratón y el uso de líneas celulares establecidas. Establecimos con éxito sistemas de información para los cuatro factores de células madre humanas, incluidos OOT4, NANOG, SOX2 y MYC. Los sistemas indicadores permiten una detección de alto rendimiento de ARNsa en células de fibroblastos primarios. Utilizando un vector indicador para el promotor MYC, identificamos varios ARNsa activadores para el gen MYC en células BJ de fibroblastos humanos. Actualmente estamos utilizando el mismo sistema para detectar ARNsa en busca de otros genes. También estamos utilizando la plataforma de reprogramación iPS de ratón para detectar saRNA que ayudan a la reprogramación sin conocer primero su capacidad en la activación genética y hemos identificado con éxito cuatro saRNA para el gen Myc de ratón. Reemplazar el retrovirus Myc por saRNA aumentó significativamente la cantidad de clones de iPS en comparación con la cantidad de clones de células infectadas por los 3 factores restantes (Oct4, Sox2 y Klf4) solos. Este resultado proporcionó una prueba de principio de que los saRNA se pueden detectar directamente en una plataforma de reprogramación de iPS. A continuación, trasladaremos este método de detección a células humanas y lograremos la reprogramación de iPS reemplazando el virus por otros factores de células madre, en particular OCT4. Dado que las líneas celulares de cáncer establecidas son fáciles de transfectar con ARN pequeño, también utilizamos líneas celulares de cáncer humano para detectar ARNsa en busca del gen KLF4 y pudimos identificar un ARNsa potente. La activación de KLF4 mediada por ARNa provocó la modulación de sus genes regulados, incluidos varios genes del ciclo celular. Estos resultados se recapitularon completamente mediante la sobreexpresión de KLF4 basada en vectores retrovirales, validando así el ARNa como un método para restaurar la función de los genes endógenos. Las investigaciones en curso están identificando saRNA para factores adicionales de células madre y maximizando la activación genética mediante la optimización de la nucleofección de saRNA y mediante un tratamiento combinatorio con agentes modificadores epigenéticos.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Propusimos generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas mediante una técnica libre de virus llamada activación de ARN (ARNa). El ARNa es un mecanismo de regulación genética recientemente identificado mediante el cual el ARN pequeño bicatenario dirigido al promotor, también conocido como ARN activador pequeño (ARNsa), puede inducir la expresión génica. Nuestro enfoque para la derivación de células iPS es mediante la activación simultánea de factores de células madre, incluidos OCT4, NANOG, SOX2 y KLF4, utilizando ARNa. Actualmente nos estamos centrando en los objetivos 1 y 2 de este proyecto para detectar saRNA que puedan activar factores de células madre individuales y utilizar los saRNA identificados para reemplazar un factor viral a la vez para reprogramar células iPS a partir de células somáticas. Hemos identificado saRNA para OCT4, KLF4 y NANOG. La sustitución del virus OCT4 en la receta de reprogramación de cuatro factores de OSKM (OCT4, SOX2, KLF4 y MYC) por un ARNsa de OCT4 condujo a la derivación de colonias similares a iPS a partir de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC). Estos resultados proporcionaron una prueba de principio de que los saRNA se pueden utilizar para la reprogramación de iPS. La investigación en curso está identificando saRNA para factores adicionales de células madre y maximizando la activación genética optimizando el protocolo de reprogramación de iPS. Con el tiempo, todos los virus serán reemplazados por sus correspondientes ARNsa para generar células iPS libres de virus.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Propusimos generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas mediante una técnica libre de virus llamada activación de ARN (ARNa). El ARNa es un mecanismo de regulación genética recientemente identificado mediante el cual el ARN pequeño bicatenario dirigido al promotor, también conocido como ARN activador pequeño (ARNsa), puede inducir la expresión génica. Nuestro enfoque para la derivación de células iPS es mediante la activación simultánea de factores de células madre, incluidos OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 y C-MYC, utilizando ARNa. Actualmente nos estamos centrando en los objetivos 1 y 2 de este proyecto para detectar saRNA que puedan activar factores de células madre individuales y utilizar los saRNA identificados para reemplazar un factor viral a la vez para reprogramar células iPS a partir de células somáticas. Hemos identificado saRNA para OCT4, KLF4, NANOG y C-MYC. La sustitución del virus OCT4 en la receta de reprogramación de cuatro factores de OSKM (OCT4, SOX2, KLF4 y MYC) por un ARNsa de OCT4 condujo a la derivación de colonias similares a iPS a partir de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC). Estos resultados proporcionaron una prueba de principio de que los saRNA se pueden utilizar para la reprogramación de iPS. Las investigaciones en curso están maximizando la activación genética y la inducción de iPS modificando el diseño de saRNA, el uso de compuestos de moléculas pequeñas y optimizando los protocolos de reprogramación de iPS. Con el tiempo, todos los virus serán reemplazados por sus correspondientes ARNsa para generar células iPS libres de virus.
Período de información:
Año 4 (NCE)
Propusimos generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas mediante una técnica libre de virus llamada activación de ARN (ARNa). El ARNa es un mecanismo de regulación genética recientemente identificado mediante el cual apuntar a elementos reguladores de genes conocidos como promotores utilizando un pequeño ARN activador (saRNA) puede inducir la actividad genética. Nuestra estrategia de derivación de células iPS se basa en el uso de ARNsa para estimular la expresión endógena de varios factores de células madre, incluidos OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 y C-MYC, que se sabe que pueden inducir células iPS si se ven obligadas a expresarse. utilizando vectores virales. Adoptamos un enfoque de tres pasos que implicó primero la detección de ARNsa que podrían activar factores de células madre individuales, luego usar los ARNsa identificados para reemplazar un factor viral a la vez y, eventualmente, reemplazar todos los factores virales para reprogramar células iPS a partir de células somáticas. Hemos identificado saRNA para OCT4, KLF4, NANOG y C-MYC. La sustitución del virus OCT4 en la receta de reprogramación de cuatro factores de OSKM (OCT4, SOX2, KLF4 y MYC) por un ARNsa de OCT4 condujo a la derivación de colonias similares a iPS a partir de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC). También descubrimos que un ARNsa NANOG que induce la expresión de NANOG puede antagonizar la diferenciación de células madre inducida por el ácido retinoico. Estos resultados proporcionaron una prueba de principio de que los ARNsa se pueden utilizar para la manipulación del destino celular. A pesar de que se han logrado resultados prometedores, es necesario sortear obstáculos importantes antes de alcanzar nuestro objetivo final de obtener células iPS libres de virus. Las investigaciones en curso están optimizando la reprogramación inducida por saRNA modificando el diseño de saRNA y los protocolos de reprogramación de iPS y el uso de compuestos de moléculas pequeñas. También se está probando una estrategia alternativa de conversión directa de un tipo de célula a otro mediante ARNa.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Inducción de células madre pluripotentes mediante activación transcripcional guiada por ARN pequeño
Resumen público:
Las células madre embrionarias tienen un gran potencial en uso terapéutico para reemplazar tejidos enfermos o dañados porque tienen la capacidad única de dar lugar a cualquier tipo de célula del cuerpo y al mismo tiempo perpetuar su propia identidad, incluso después de repetidas divisiones celulares. Los avances recientes en esta área han dado como resultado una nueva forma de generar células madre a partir de células adultas especializadas mediante la introducción de 3 a 4 genes que codifican proteínas llamadas factores de células madre, que son altamente activas en las células madre naturales, en estas células adultas utilizando virus como portador. . Estos derivados se denominan células madre pluripotentes inducidas (iPS) y tienen propiedades muy similares a las de las células madre embrionarias. Como las células iPS pueden generarse a partir de los propios tejidos del paciente, se evitan los problemas asociados con el rechazo inmunológico. Además, este proceso no utiliza embriones, por lo que no existen preocupaciones éticas. Desafortunadamente, el uso de virus para generar estas células es problemático porque el virus también puede activar genes dañinos en las células, como los que causan cáncer. Recientemente desarrollamos una forma de activar genes inactivos en células humanas utilizando pequeñas moléculas de ARN en lugar de virus, y acuñamos la técnica "ARNa" para la activación de genes inducida por ARN. Hemos demostrado que el ARNa puede inducir una activación robusta y prolongada de una variedad de genes. Por lo tanto, el ARNa parece muy adecuado para reemplazar la reprogramación mediada por virus como medio para generar células iPS. El objetivo principal de esta aplicación es desarrollar un método novedoso para transformar células adultas en células madre sin utilizar virus. La realización de nuestro estudio acercará las células iPS un paso más a la aplicación clínica de la terapia con células madre.
Declaración de beneficio para California:
El objetivo de esta aplicación es desarrollar nuevos enfoques para la generación de líneas de células madre pluripotentes sin utilizar virus como vector de expresión génica. Las células madre así generadas se pueden utilizar para reemplazar tejidos enfermos o dañados sin preocuparse por efectos adversos relacionados con el virus, como la mutagénesis por inserción. El éxito de estos enfoques beneficiará la salud de la población y la economía del Estado de California. Los californianos sufren muchas enfermedades y lesiones que se pueden tratar mediante el uso de células madre, como la enfermedad de Parkinson y Alzheimer, la diabetes y el cáncer. Las nuevas líneas de células madre y reactivos que generemos probablemente serán comercializados por empresas de biotecnología con sede en California y, por lo tanto, generarán ingresos y nuevas oportunidades laborales para el estado.
