Inestabilidad genómica durante el cultivo de células madre embrionarias humanas.

El primer año de nuestro proyecto CIRM fue un gran éxito porque cumplimos nuestros objetivos de establecer los clones de células madre embrionarias humanas (hESC) genéticamente modificados y los sistemas de ensayo necesarios para realizar los experimentos propuestos sobre cómo las condiciones de cultivo en el laboratorio pueden influir. la estabilidad de los cromosomas hESC. Los clones de hESC que desarrollamos nos permitirán monitorear cómo las condiciones de cultivo influyen en las tapas de los extremos de los cromosomas, llamadas telómeros, que son esenciales para mantener la estabilidad de los cromosomas. Nuestros estudios anteriores en células madre embrionarias (ES) de ratón y células cancerosas humanas utilizando este mismo sistema han demostrado que la pérdida de telómeros puede provocar muchos de los reordenamientos cromosómicos que provocan cáncer. Por lo tanto, tener estos clones de hESC genéticamente modificados ayudará a determinar las condiciones de cultivo que previenen la pérdida de telómeros y el cáncer por parte de hESC. También hemos dedicado una gran cantidad de tiempo a adaptar varios sistemas de ensayo para monitorear cómo las condiciones de cultivo influyen en el estrés oxidativo, la pérdida de telómeros, la estabilidad cromosómica y la diferenciación de hESC. Esta fase inicial de nuestro estudio consumió mucho tiempo, porque las características únicas y las condiciones de cultivo de las hESC requirieron que cada sistema de ensayo se adaptara específicamente para las hESC. Sin embargo, estos sistemas de ensayo ya están disponibles y hemos iniciado nuestros estudios para monitorear periódicamente el estado de estos diversos criterios de valoración durante el cultivo de las hESC en diferentes condiciones en el laboratorio. Estos estudios nos permitirán determinar si la pérdida de telómeros y la inestabilidad cromosómica en las hESC pueden provocar cambios cromosómicos que provoquen cáncer y proporcionarán información fundamental sobre cómo cultivar hESC para evitar alteraciones específicas que podrían provocar cáncer durante la terapia con hESC.

El segundo año de nuestro proyecto CIRM fue muy productivo porque pudimos establecer y utilizar con éxito una variedad de ensayos para monitorear los cambios nocivos que podrían ocurrir en las células madre embrionarias humanas hESC durante el crecimiento en cultivo. Estos estudios son importantes porque proporcionan información valiosa sobre cómo evitar alteraciones en las hESC durante el crecimiento en cultivo que podrían hacer que causen cáncer cuando se introduzcan en humanos. Estos ensayos están diseñados para detectar alteraciones en las hESC provocadas por el estrés del crecimiento ilimitado en cultivo, incluidos cambios en el número de cromosomas, disfunción de las tapas en los extremos de los cromosomas, llamadas telómeros, y estrés oxidativo. Los telómeros son particularmente importantes para estos estudios, porque se ha demostrado que son muy sensibles al estrés celular provocado por la división celular continua y el daño debido al oxígeno, que puede ocurrir en células cultivadas. Aunque la mayoría de los ensayos mostraron pequeños cambios en las hESC durante el crecimiento en cultivo, el ensayo Q-FISH para monitorear los telómeros demostró cantidades significativas de disfunción de los telómeros en las hESC cultivadas. Esta función de los telómeros tiene consecuencias perjudiciales para la estabilidad de los cromosomas hESC, como lo demuestra la presencia de puentes de anafase, que se producen cuando los cromosomas se fusionan tras la pérdida de un telómero. Actualmente estamos utilizando el ensayo Q-FISH para abordar el motivo de la disfunción de los telómeros en las hESC cultivadas. Nuestros resultados hasta ahora han demostrado que la disfunción de los telómeros no se ve afectada por cambios en el nivel de oxígeno, lo que sugiere que el daño oxidativo no es responsable. Sin embargo, la adición de un factor de crecimiento, la activina A, que aumenta la tasa de crecimiento de las hESC, provocó un aumento del 50 % en la disfunción de los telómeros. Este resultado sugiere que la disfunción de los telómeros en las hESC en cultivo es el resultado del estrés de replicación, que ocurre cuando las células se dividen continuamente en condiciones adversas. Por lo tanto, ahora estamos utilizando el ensayo Q-FISH para explorar alteraciones en las condiciones de crecimiento que pueden mejorar este estrés. La segunda parte de nuestro proyecto es investigar las consecuencias de la pérdida de telómeros en hESC. Nuestros estudios previos con células madre embrionarias de ratón demostraron que la pérdida de telómeros resultante de una rotura del ADN adyacente a un telómero resultó en una fusión cromosómica que conduce a una inestabilidad cromosómica extensa. Otros laboratorios han demostrado que reordenamientos cromosómicos similares resultantes de la pérdida de telómeros pueden provocar cáncer en ratones. Es importante destacar que también descubrimos que las células madre embrionarias de ratón eran capaces de prevenir esta inestabilidad cromosómica añadiendo un nuevo telómero al sitio de la rotura, un proceso llamado curación cromosómica. Hemos demostrado que la curación cromosómica desempeña un papel vital en la prevención de la inestabilidad cromosómica debido a una deficiencia en otros mecanismos de reparación del ADN cerca de los telómeros. Nuestros estudios en células madre embrionarias de ratón requirieron la introducción de secuencias de ADN en ubicaciones cercanas a los telómeros para poder introducir roturas en el ADN en ubicaciones específicas y seleccionar células que habían perdido un telómero. Este método nos permite simular procesos normales en un telómero definido, lo que nos permite estudiar las consecuencias de la pérdida de telómero. Para realizar estudios similares en hESC, ahora hemos generado clones de hESC que contienen estas mismas secuencias de ADN integradas adyacentes a un telómero. Ahora estamos en el proceso de generar roturas de ADN en estas ubicaciones cercanas a los telómeros en los clones de hESC para determinar si la pérdida de telómeros en hESC también resulta en inestabilidad cromosómica y si la curación de los cromosomas puede prevenir esta inestabilidad cromosómica. Estos estudios nos permitirán determinar si la pérdida de telómeros y la inestabilidad cromosómica en las hESC pueden provocar cambios cromosómicos que conduzcan al cáncer, y proporcionarán información fundamental sobre cómo cultivar las hESC para evitar alteraciones específicas que podrían conducir al cáncer durante la terapia con hESC.

El tercer y último año de nuestro proyecto CIRM fue muy exitoso en algunos aspectos y decepcionante en otros. Adaptamos una variedad de sistemas de ensayo para monitorear cómo las condiciones de cultivo influyen en el bienestar de las hESC en cultivo para asegurar que estén en condiciones óptimas para ser introducidas en humanos. Estos ensayos monitorearon el estrés oxidativo, la pérdida de telómeros, la estabilidad cromosómica y la diferenciación. Descubrimos que la mayoría de estos ensayos no proporcionaron información útil sobre el estado de las hESC en cultivo. Sin embargo, uno de los ensayos demostró ser muy valioso y ahora puede usarse como herramienta para optimizar la forma en que se cultivan las hESC en cultivo. Este ensayo se llama Q-FISH y se utiliza para monitorear el estado de los telómeros, que son las tapas en los extremos de los cromosomas. Los telómeros son muy susceptibles al estrés celular y Q-FISH proporciona una forma de controlar si los telómeros son disfuncionales. Demostramos que, si bien agregar algunos factores de crecimiento a los cultivos de hESC puede aumentar su tasa de crecimiento, esto no siempre es algo bueno, ya que puede promover el estrés de replicación y la disfunción de los telómeros, lo que puede conducir a la inestabilidad cromosómica. Debido a que la inestabilidad cromosómica puede generar células cancerosas, debe limitarse siempre que sea posible. También descubrimos que agregar los componentes básicos de nucleósidos para el ADN al medio de cultivo puede limitar el estrés de replicación en las hESC. Por lo tanto, Q-FISH es una herramienta importante para optimizar y limitar el estrés de replicación en hESC cultivadas en cultivo. La segunda parte de nuestro estudio resultó ser mucho más frustrante. Esta parte del proyecto implicó el desarrollo de clones de hESC en los que insertamos genes específicos adyacentes a los telómeros en los extremos de los cromosomas. Este enfoque nos permite monitorear cuándo se pierde un telómero y las consecuencias de la pérdida de telómero para la inestabilidad cromosómica y el cáncer. Hemos utilizado con éxito este enfoque para estudiar las consecuencias de la pérdida de telómeros en células tumorales humanas y células madre embrionarias de ratón. El proyecto comenzó bien porque logramos generar tres clones de hESC diferentes que tienen los genes necesarios integrados junto a un telómero. Sin embargo, a pesar de un esfuerzo considerable, no pudimos aislar células en las que se había perdido el telómero. Por lo tanto, no pudimos realizar los estudios en profundidad que hemos realizado anteriormente en células tumorales humanas y células madre embrionarias de ratón. Con base en nuestros resultados, ahora llegamos a la conclusión de que la razón de nuestros resultados frustrantes es que las hESC son muy sensibles a la pérdida de telómeros y que las hESC que pierden un telómero no logran proliferar, ya sea debido a la muerte celular o a la diferenciación y detención del ciclo celular. Es importante destacar que, si bien esto fue malo para nuestro proyecto, es alentador para el uso de hESC en humanos, ya que significa que las hESC tienen vías muy sensibles para prevenir la inestabilidad cromosómica debido a la pérdida de telómeros.