Generación de células y órganos funcionales a partir de iPSC.

La inmunoterapia adoptiva con células T funcionales es una estrategia terapéutica potencialmente eficaz contra diversos tipos de cánceres e infecciones virales. Sin embargo, un desafío importante radica en el "agotamiento" (pérdida de capacidades citotóxicas y proliferativas) de las células T específicas de antígeno durante la expansión en cultivo. Para una inmunoterapia adoptiva eficaz, lo que necesitamos no son células T "agotadas", sino una gran cantidad de células T CD8+ "jóvenes y activas" que puedan matar tumores o células infectadas por virus de manera eficiente. Para abordar este problema, generamos células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células T CD8+ específicas del VEB de un paciente infectado con el VEB. Luego rediferenciamos estas iPSC en células T CD8+ o nos gusta llamarlas células T "rejuvenecidas", ya que son de nueva generación y altamente proleferativas. Estas células rejT poseían actividad de destrucción específica de antígeno y exhibían patrones de reordenamiento del gen TCR idénticos a los del clon de células T original del paciente. Para confirmar la eficacia in vivo de estas células rejT, inoculamos tumores inducidos por EBV en ratones inmunodeficientes y, después de confirmar el crecimiento del tumor, inyectamos estas células rejT. Los resultados indicaron que estas células rejT eliminaron tumores de manera más eficiente que las células T CD8+ específicas del VEB originales, lo que confirma la eficacia in vivo de estas células T. Otro aspecto que trabajamos es la generación de un órgano funcional en animales de ganadería. En el pasado, hemos demostrado la generación de páncreas de rata en ratón utilizando un método llamado "complementación de blastocistos". En un trabajo auxiliar, generamos con éxito páncreas de cerdo exógeno utilizando el mismo principio. Si bien estos estudios nos prepararon para examinar la viabilidad de generar páncreas humano derivado de PSC en cerdos con pancreatogénesis discapacitada, aún deben resolverse algunas cuestiones éticas sobre la fabricación de tales "quimeras mixtas". Parte de la preocupación proviene de la posibilidad de que las células derivadas de iPSC humanas contribuyan a las células neurales o germinales en animales quiméricos. Para superar este problema, intentamos restringir la diferenciación de células derivadas de PSC en órganos endodérmicos mediante la introducción de un gen que es importante para el desarrollo de los órganos internos. Cuando se indujo la expresión de este gen después de la transferencia del embrión a la madre adoptiva, la diferenciación de las células derivadas de ES se dirigió hacia los órganos internos evitando la contribución de esas células en las células germinales, la piel y el sistema nervioso. A este tipo de generación de órganos lo denominamos "generación de órganos dirigida" y esto debería, en principio, reducir la preocupación ética a la hora de fabricar quimeras entre humanos y ganado. Además, descubrimos que la inhibición de la translocación nuclear de una molécula llamada b-CATENINA mejora la conversión de EpiSC de ratón (que no forman quimeras) en PSC similares a las ingenuas (que forman quimeras). Dado que la mayoría de las ES/iPSC humanas se consideran EpiSC y no forman quimeras, el hallazgo es de importancia para la generación de órganos humanos en animales ivestock.

En este proyecto, utilizando células madre, intentamos generar no sólo células para terapia celular sino también órganos trasplantables para personas con insuficiencia orgánica terminal. El siguiente es un resumen de nuestros avances realizados en la generación de células y órganos a partir de células madre. La inmunoterapia adoptiva con células T es una posible estrategia terapéutica para combatir varios tipos de cáncer. Sin embargo, las células T altamente expandidas no han demostrado ser particularmente efectivas. Esto se explica en parte por el agotamiento y las pérdidas de función que se producen durante la expansión ex vivo de las células T. Para una inmunoterapia adoptiva eficaz, lo que necesitamos no son células T "agotadas", sino un gran número de células T "jóvenes y activas" que puedan matar tumores. Para abordar este problema, hemos desarrollado recientemente un nuevo sistema en el que las células T asesinas (CTL) específicas de antígeno se pueden rejuvenecer reprogramándolas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y rediferenciandolas mientras se expande su número, produciendo abundantes células T rejuvenecidas. (células rejT). Confirmamos la eficacia in vivo de estas células rejT contra tumores inducidos por EBV inoculados en ratones inmunodeficientes. Para aumentar la seguridad de esta nueva terapia con células rejT, insertamos un sistema suicida inducible por fármacos en las iPSC derivadas de células T. Tanto las iPSC como las células rejT derivadas de ellas indujeron la muerte celular después de la administración del fármaco inductor in vivo, demostrando así la eficacia de este sistema de seguridad. Los resultados facilitan la aplicación clínica de la terapia con células rejT y otras ramas de la medicina regenerativa derivada de iPSC. Para ayudar a los pacientes con insuficiencia orgánica terminal que esperan un trasplante de órganos, estamos intentando generar órganos trasplantables en animales de ganado. Anteriormente hemos demostrado la generación de páncreas de rata en ratón utilizando la técnica de complementación interespecífica de blastocistos. Esta vez logramos generar páncreas de ratón en ratas. El páncreas generado estaba compuesto de células derivadas de PSC de ratón pero eran del tamaño de una rata. Se prepararon islotes a partir de estos páncreas y se trasplantaron a ratones diabéticos. Los islotes trasplantados normalizaron y mantuvieron con éxito los niveles de glucosa en sangre del huésped durante más de 370 días. Debido a que los islotes trasplantados contenían una pequeña cantidad de células de rata, se administró fármaco inmunosupresor a los ratones receptores durante los primeros 5 días, pero el resto del tiempo estuvo totalmente libre de inmunosupresión. Estos datos proporcionan evidencia de principio sobre el potencial terapéutico de los islotes derivados de PSC generados en un huésped xenogénico utilizando la técnica de complementación de blastocistos, nuestro objetivo final. Para aplicar este principio a la generación de órganos humanos, se necesitan PSC humanas que puedan contribuir a la formación de quimeras. Sin embargo, estudios recientes demostraron que las PSC humanas actualmente disponibles son células madre en etapa de epiblasto (EpiSC) y no pueden contribuir a la formación de quimeras. Utilizando un modelo de roedor, descubrimos que si la supervivencia celular se promueve transitoriamente mediante la sobreexpresión del gen antiapoptótico (BCL2), las EpiSC e incluso los progenitores comprometidos con el linaje pueden contribuir a la formación de quimeras tras la inyección en embriones previos a la implantación. De manera similar, demostramos que la sobreexpresión de BCL2 en PSC humanas podría aumentar su supervivencia después de la inyección en embriones de oveja in vitro. Habiendo diseñado con éxito una plataforma para eliminar el páncreas en ovejas utilizando CRISPR, ahora estamos en condiciones de evaluar qué tan bien estas PSC humanas modificadas pueden contribuir a la formación del páncreas in vivo. Creemos que la aplicación de nuestras estrategias recientemente diseñadas puede generar órganos derivados de PSC humanas, evitando contribuciones no deseadas a los gametos del huésped o a los tejidos neuronales.