Análisis genómico funcional de células madre embrionarias humanas químicamente definidas

Hemos logrado avances significativos durante el período de subvención anterior, lo que resultó en una publicación en Genome Research que detalla los cambios de metilación del ADN genómico en una variedad de células madre embrionarias humanas y sus derivados. También hemos logrado identificar regiones del genoma unidas por modificaciones de histonas y factores de transcripción en hESC y endodermo derivado. Estos objetivos han llevado a una mayor comprensión de cómo la señalización nodal y la configuración de la cromatina mantienen el estado pluripotente y posteriormente desencadenan la diferenciación. Esperamos que de este trabajo resulten 3 publicaciones durante el próximo período de subvención.

Con el objetivo de desarrollar linajes endodérmicos a partir de hESC, incluidos el hígado, el páncreas, los pulmones y el intestino, hemos desarrollado nuevas herramientas y enfoques para identificar estos subtipos, así como una comprensión molecular de cómo surgen estos subtipos. Estos avances se destacan en tres artículos que actualmente se encuentran en revisión para su publicación y uno en preparación. Dos de estos artículos redefinen los subtipos endodérmicos derivados de hESC, incluidos nuevos métodos para aislar poblaciones endodérmicas de linaje restringido y un medio para distinguir entre células endodérmicas individuales. El tercer artículo proporciona una visión sin precedentes de la vía de señalización nodal y su intersección con dominios bivalentes tanto en las hESC como en el endodermo derivado. Esta firma de cromatina, que consta de factores de transcripción Smad y marcas activas y represoras de histonas, es la más propicia para mediar objetivos posteriores de Nodal, lo que proporciona avances en cómo las vías de señalización y la cromatina cooperan durante la especificación del destino en las hESC. Este análisis ha permitido dilucidar nuevas proteínas que median la señalización nodal; los que juegan un papel clave en la especificación del endodermo.

Durante el año pasado, completamos tres proyectos de investigación como resultado de esta subvención. Dos de ellos se han publicado recientemente en Genes and Development y Developmental Biology. El tercero se encuentra actualmente en revisión en Desarrollo. Los descubrimientos informados en estos artículos se destacan a continuación: HEB y E2A funcionan como cofactores SMAD/FOXH1. La señalización nodal, mediada por factores de transcripción SMAD, es necesaria para el mantenimiento de la pluripotencia y el compromiso del endodermo. Hemos identificado un nuevo motivo, denominado SMAD Complex Associated (SCA), que está unido por SMAD2/3/4 y FOXH1 en células madre embrionarias humanas (hESC) y endodermo derivado. Demostramos que dos proteínas bHLH, HEB y E2A, se unen al motivo SCA en regiones que se superponen a SMAD2/3 y FOXH1. Además, mostramos que HEB y E2A se asocian con SMAD2/3 y FOXH1, lo que sugiere que forman un complejo en regiones objetivo críticas. Esta asociación es biológicamente importante, ya que E2A es fundamental para la especificación del mesendodermo, la gastrulación y la transducción de señales nodales en embriones de Xenopus tropicalis. En conjunto, las proteínas E son nuevos cofactores de señalización nodal que se asocian con SMAD2/3 y FOXH1 y son necesarios para la diferenciación del mesendodermo. Cromatina y firmas transcripcionales para la señalización nodal durante la formación del endodermo en hESC Las primeras etapas de la diferenciación embrionaria están impulsadas por vías de señalización programadas para inducir destinos particulares. El compromiso del endodermo está controlado por el miembro de la superfamilia TGF-β, Nodal, que utiliza los factores de transcripción SMAD2/3, SMAD4 y FOXH1 para impulsar la expresión del gen objetivo. Si bien el papel de Nodal está bien definido en el contexto del compromiso del endodermo, desde el punto de vista mecánico se desconoce cómo se manifiesta esta señal en las regiones de unión dentro del genoma y cómo esta señal interactúa con el estado de la cromatina para desencadenar respuestas posteriores. Para dilucidar la red transcripcional nodal que gobierna la formación del endodermo, utilizamos ChIP-seq para identificar objetivos genómicos para SMAD2/3, SMAD3, SMAD4, FOXH1 y las marcas de cromatina activa y represiva, H3K4me3 y H3K27me3, en células madre embrionarias humanas (hESC). y endodermo derivado. Demostramos que, si bien la unión de SMAD2/3, SMAD4 y FOXH1 es altamente dinámica, existe una firma óptima para impulsar el compromiso del endodermo. Inicialmente, esta firma está marcada tanto por H3K4me3 como por H3K27me3 como un dominio bivalente muy amplio en hESC. Dentro de las primeras 24 horas, en algunos promotores seleccionados, la acumulación de SMAD2/3 coincide con la reducción de H3K27me3, de modo que estos loci se vuelven relativamente monovalentes marcados por H3K4me3. JMJD3, una histona desmetilasa, se recluta simultáneamente en los promotores del gen endodérmico GSC y EOMES, lo que sugiere una conservación del mecanismo en múltiples promotores en todo el genoma. La correlación entre la unión de SMAD2/3, la formación monovalente y la activación transcripcional sugiere un mecanismo mediante el cual las proteínas SMAD se coordinan con la cromatina en promotores críticos para impulsar la especificación del endodermo. Distinguir células con transcripciones internas Distinguir entre tipos de células es fundamental para una amplia gama de campos biológicos y es fundamental para el avance de la medicina regenerativa y el diagnóstico del cáncer. En este informe, utilizamos la expresión de genes unicelulares para identificar patrones transcripcionales que surgen durante la diferenciación de células madre embrionarias humanas hESC en el linaje endodérmico. Las transcripciones específicas del endodermo son muy variables entre las células endodérmicas CXCR4+ individuales, lo que sugiere que las células generadas a partir de la diferenciación in vitro son distintas o que estas células embrionarias toleran un alto grado de variabilidad de la transcripción. Las transcripciones internas, por otra parte, se expresan de manera mucho más consistente dentro de la misma población celular. Sin embargo, cuando comparamos los niveles de transcripciones internas entre las hESC y el endodermo derivado, surgen patrones que pueden usarse para separar claramente los dos tipos de células embrionarias. Además, comparamos 4 tipos de células humanas adicionales, incluidas 293T, iPSC, HepG2 y iPSC derivadas de endodermo. En cada caso, los niveles relativos de transcripciones internas definieron un destino celular particular. Curiosamente, encontramos que tres transcritos, LDHA, NONO y ACTB, contribuyen más a esta diversidad y juntos sirven para segregar los 6 tipos de células. En general, esto sugiere que los niveles de transcripciones de mantenimiento, que se expresan en todas las células, pueden aprovecharse para distinguir entre tipos de células humanas y, por lo tanto, pueden servir como biomarcadores importantes para la biología de células madre y otras disciplinas.