El eje EphrinB2/EphB4 en la regulación de la pluripotencia y diferenciación de hESC

Las células madre embrionarias humanas (hESC) tienen una capacidad inagotable para dividirse y renovarse y, en las condiciones adecuadas, diferenciarse y transformarse en cualquier tipo de célula del cuerpo. Este equilibrio entre pluripotencia y autorrenovación es una respuesta compleja y cuidadosamente coreografiada del hESC a señales microambientales locales. Comprender los reguladores moleculares de este equilibrio y las diversas señales que integran las hESC para mantener sus características de pluripotencia y autorrenovación son fundamentales para la expansión y diferenciación de las hESC en tipos de células específicos. EphrinB2 y ephB4 son moléculas de la superficie celular que median y transducen cascadas de señalización al interactuar entre sí. Los contactos célula-célula entre las células que expresan ephrinB2 y ephB4 proporcionan señales de orientación para la migración celular y la formación de límites en muchos sistemas de desarrollo, como la formación de neuronas y vasos sanguíneos. Es importante destacar que se ha determinado que ephrinB2 es un marcador molecular de "troncalidad" y se expresa en células madre embrionarias humanas, células madre neurales y células madre hematopoyéticas. A pesar de mucha evidencia de sistemas modelo de que el eje ephrinB2/ephB4 puede estar íntimamente involucrado en el destino de las ESC (supervivencia, autorrenovación y pluripotencia), este eje en particular no se ha estudiado cuidadosamente en las ESC humanas debido a la falta de reactivos altamente específicos para bloquear. interacciones afines ephrinB2-ephB4. Curiosamente, la proteína de la envoltura de un virus exótico y altamente letal llamado virus Nipah se une a ephrinB2 más "estrechamente" que al receptor EphB4 y, por lo tanto, puede competir o interferir con las interacciones normales de ephrin-B2-EphB4. Utilizando un arsenal de reactivos basados ​​en versiones modificadas genéticamente de esta proteína de la envoltura viral, que conserva las propiedades de unión de ephrinB2 sin la virulencia del virus real, propusimos interrogar el papel del eje ephrinB2-ephB4 en la regulación de la capacidad de las hESC para proliferar, autoinhibirse. -renovarse y diferenciarse en cualquier tipo de células que componen el cuerpo humano. Las hESC prefieren crecer en grupos y propagarse como un ecosistema de células complejo y dinámico donde cada célula puede tener una capacidad diferente de pluripotencia o autorrenovación. Primero preguntamos si ephrinB2 se expresaba de manera homogénea en hESC y, de no ser así, ¿ephrinB2 marca una subpoblación dentro de cultivos de hESC con propiedades distintas? Para hacer esto, infectamos hESC con lentivirus indicadores de GFP que contienen proteínas de envoltura Nipah (NiVpp para partículas pseudotipadas de NiV), que solo pueden infectar células ephrinB2+. Descubrimos que NiVpp infectó consistentemente solo entre el 5 y el 20 % de las hESC durante las rondas de infección primaria y secundaria, aunque podemos purificar la subpoblación inicialmente infectada hasta alcanzar una homogeneidad cercana (> 85 %) entre las rondas de infección. Esto sugiere que ephrinB2 no es un marcador de superficie celular estable para una subpoblación distinta de células. Sin embargo, las hESC ephrinB2+ parecen representar una subpoblación de hESC con una capacidad de autorrenovación disminuida cuando se someten a las pruebas adecuadas. Curiosamente, estas hESC infectadas con NiVpp aún mantuvieron la capacidad de formar teratomas, aunque más pequeños, cuando se inyectaron en ratones SCID. En conjunto, nuestros resultados muestran que la pluripotencia y la autorrenovación son propiedades distintas y disociables de las hESC y no necesariamente residen dentro de una célula particular en el cultivo de hESC. A continuación, intentamos determinar si el eje ephrin2-EphB4 desempeña un papel en la regulación de la capacidad de las hESC para diferenciarse en las tres capas germinales principales que forman las células de los diversos órganos y tejidos del cuerpo humano. La diferenciación es una respuesta molecular y celular cuidadosamente coreografiada a los determinantes ambientales locales. La formación in vitro de cuerpos embrioides, donde se puede detectar la expresión de marcadores genéticos para las tres capas germinales, es un ensayo in vitro sustituto de la pluripotencia. En condiciones estándar, los cuerpos embrioides forman grupos esféricos extremadamente heterogéneos que dificultan la cuantificación reproducible de cualquier diferencia en el compromiso de la capa germinal que podría resultar como consecuencia de las interacciones antagónicas de EphrinB2-EphB4. Por lo tanto, optimizamos un ensayo de "cuerpo embrioide giratorio" en el que se podía controlar cuidadosamente la cantidad de hESC por cuerpo embrioide formado. En estas condiciones, la expresión de efrina-B2 aumentó drásticamente entre los días 10 y 15, lo que refleja fielmente la regulación positiva de los marcadores del ectodermo (la capa germinal que forma células como las neuronas) y, en menor medida, de los marcadores del mesodermo (la capa germinal que forma células como las neuronas). células endoteliales). Los marcadores de enodermo (la capa germinal que forma células como las que recubren el intestino) se regulan drásticamente a la baja durante los primeros 10 días y no alcanzan su punto máximo hasta los días 15 a 20. Estos emocionantes resultados de nuestro primer año sugieren que las interacciones ephrinB2-EphB4 probablemente juegan un papel en la regulación de la formación del ectodermo y el mesodermo, y que antagonizar este eje utilizando nuestros reactivos basados ​​en la envoltura de Nipah iluminará estos procesos de diferenciación temprana.

Resumen público de la introducción del progreso científico. EphrinB2 y ephB4 son moléculas de la superficie celular que median y transducen cascadas de señalización al interactuar entre sí. Los contactos célula-célula entre las células que expresan ephrinB2 y ephB4 proporcionan señales de orientación para la migración celular y la formación de límites en muchos sistemas de desarrollo, como la formación de neuronas y vasos sanguíneos. Es importante destacar que se ha determinado que ephrinB2 es un marcador molecular de "troncalidad" y se expresa en células madre embrionarias humanas, células madre neurales y células madre hematopoyéticas. A pesar de mucha evidencia de sistemas modelo de que el eje ephrinB2/ephB4 puede estar íntimamente involucrado en el destino de las ESC (supervivencia, autorrenovación y pluripotencia), este eje en particular no se ha estudiado cuidadosamente en las ESC humanas debido a la falta de reactivos altamente específicos para bloquear. interacciones afines ephrinB2-ephB4. Curiosamente, la proteína de la envoltura de un virus exótico y altamente letal llamado virus Nipah (NiV) se une a la efrina B2 más "estrechamente" que al receptor EphB4 y, por lo tanto, puede competir o interferir con las interacciones normales de efrina-B2-EphB4. Las proteínas de la envoltura de NiV pseudotipadas en partículas lentivirales también pueden transducir específicamente células que expresan EfrinB2. Por lo tanto, utilizando un arsenal de reactivos basados ​​en versiones diseñadas de esta proteína de la envoltura viral, que conserva las propiedades de unión de ephrinB2 sin la virulencia del virus real, propusimos interrogar el papel del eje ephrinB2-ephB4 en la regulación de la capacidad de las hESC para proliferar. , autorrenovarse y diferenciarse en cualquier tipo de célula que constituya el cuerpo humano. En el año 1, utilizando la transducción lentiviral mediada por envoltura de NiV para marcar las hESC de ephrinB2+, encontramos que las células de ephrinB2+ se mantuvieron homeostáticamente en un 5-20% del total de hESC de SSEA4+, incluso si las células de ephrinB2+ se purificaron hasta casi la homogeneidad (>85%) entre pases. Estos resultados indican que ephrinB2 no marca una subpoblación distinta estable de hESC; en cambio, la expresión de ephrinB2 podría representar un marcador de la heterogeneidad intrínseca de las células madre que debe mantenerse en un cierto porcentaje de hESC en cultivo para que la línea mantenga todas las propiedades cardinales de las células madre. Sin embargo, la subpoblación de hESC ephrinB2+ parece tener una capacidad de autorrenovación disminuida, aunque mantuvieron la capacidad de formar teratomas, aunque más pequeños, cuando se inyectaron en ratones SCID. Utilizando un ensayo de “cuerpo embrioide de espín” (EB de espín) como ensayo sustituto in vitro para la pluripotencia y monitoreando el transcurso del tiempo y los niveles de expresión de varios marcadores de diferenciación de la capa germinal después de la formación de EB de espín, encontramos que la expresión de ephrinB2 reflejaba fielmente la regulación positiva de marcadores de ectodermo (la capa germinal que forma células como las neuronas) y, en menor medida, marcadores de mesodermo (la capa germinal que forma células como las células endoteliales y las células madre hematopoyéticas). Estos resultados sugieren que las interacciones ephrinB2-EphB4 probablemente desempeñen un papel en la regulación de la formación de ectodermo y mesodermo, y que antagonizar este eje utilizando nuestros reactivos basados ​​en envoltura Nipah iluminará estos procesos de diferenciación temprana. En el año 2, examinamos los efectos de antagonizar el eje ephrinB2-ephB4 generando hESC estables (líneas celulares H9 y UCLA1) que expresan la glicoproteína de unión soluble de NiV (sNiV-G) o un ARN en horquilla corta contra ephrinB2 (shB2). sNiV-G se une a ephrinB2 y debería evitar la señalización bidireccional a través del eje ephrinB2-ephB4, mientras que shB2 reduce la expresión del ARNm de ephrinB2 en un 50-80%. Las hESC que expresan sNiV-G pierden gradualmente sus marcadores de pluripotencia (SSEA4 y Oct-4) mientras regulan al alza los marcadores de ectodermo como Pax6 en 100 veces. Por otro lado, las hESC que expresan shB2 exhibieron defectos marcados en la diferenciación del ectodermo (pax6 y NeuroD) cuando se analizaron utilizando el método spin EB bajo protocolos de diferenciación espontánea. Cuando el método spin EB se realizó bajo diferenciación de mesodermo dirigida, las hESC shB2 mostraron una disminución de 10 veces en los niveles de CD34 en comparación con las hESC de control, lo que indica un defecto en la diferenciación de las células endoteliales y/o de las células hematopoyéticas. En conjunto, nuestros resultados muestran que antagonizar el eje ephrinB2-ephB4 puede afectar la pluripotencia de las hESC, específicamente con respecto a la diferenciación de ectodermo y mesodermo. Curiosamente, antagonizar físicamente la señalización de ephrinB2-ephB4 en trans (a través de la unión de sNiV-G secretada a ephrinB2) y eliminar la expresión de ephrinB2 en cis (a través de la disminución mediada por shB2 en el ARNm de ephrinB2) parece revelar los diferentes roles que puede desempeñar el eje ephrinB2-ephB4. en la diferenciación de ectodermo y mesodermo. Los experimentos futuros examinarán estas supuestas diferencias con mayor detalle y también confirmarán su fenotipo en la pluripotencia de hESC in vivo mediante el uso de ensayos de formación de teratomas.

Introducción. Se ha determinado que EphrinB2 es un marcador molecular de "troncalidad" y se expresa en células madre embrionarias humanas, células madre neurales y células madre hematopoyéticas. Sin embargo, el eje de señalización de ephrinB2 no se ha estudiado cuidadosamente en ESC humanos debido a la falta de reactivos altamente específicos para bloquear las interacciones afines de ephrinB2-ephB4. Curiosamente, la proteína de la envoltura del virus Nipah (NiV) se une a ephrinB2 con muy alta afinidad y especificidad y, por lo tanto, puede competir o interferir con las interacciones normales de ephrinB2 con sus receptores Eph afines. Las proteínas de la envoltura de NiV pseudotipadas en partículas lentivirales también pueden transducir específicamente células efrinB2+. Por lo tanto, utilizando un arsenal de reactivos basados ​​en versiones diseñadas de esta proteína de la envoltura viral, propusimos interrogar el papel del eje de señalización ephrinB2 en la regulación de la capacidad de las hESC para proliferar, autorrenovarse y diferenciarse en cualquier tipo de célula que constituya el cuerpo humano. En el año 1, utilizando la transducción lentiviral mediada por envoltura de NiV para marcar hESC de ephrinB2+, encontramos que las células de ephrinB2+ se mantuvieron homeostáticamente en ~20% del total de hESC SSEA4+, incluso después de una purificación repetida entre pases. Por lo tanto, ephrinB2 no marca una subpoblación estable e independiente de hESC. En cambio, ephrinB2 puede ser un marcador intrínseco de la heterogeneidad de las células madre; quizás un marcador emergente que surge del modelo de pluripotencia de la mecánica estadística propuesto recientemente por MacArthur y Lemischka (Cell, 2013). La expresión de EphrinB2 reflejó fielmente la regulación positiva de los marcadores de ectodermo y, en menor medida, de los marcadores de mesodermo en un ensayo de "cuerpo embrioide de espín" (EB de espín), que utilizamos como ensayo sustituto in vitro para evaluar la pluripotencia. Nuestros resultados sugieren que el eje de señalización ephrinB2 probablemente desempeña un papel en la regulación de la formación de ectodermo y mesodermo, y que antagonizar este eje utilizando nuestros reactivos basados ​​en la envoltura de Nipah iluminará estos procesos de diferenciación temprana. En el año 2, examinamos los efectos de antagonizar el eje de señalización de ephrinB2 generando hESC estables (H9 y UCLA1) que expresan la glicoproteína env de NiV soluble (sNiV-G) o un ARN en horquilla corta contra ephrinB2 (shB2). sNiV-G debería unirse ávidamente a ephrinB2 y antagonizar el complejo eje de señalización directo e inverso del receptor de Eph-ligando de Ephrin, mientras que shB2 derriba la expresión del ARNm de ephrinB2. Las hESC que expresan sNiV-G pierden gradualmente sus marcadores de pluripotencia (SSEA4 y Oct-4) mientras regulan al alza los marcadores de ectodermo como Pax6 en 100 veces. Por otro lado, las hESC que expresan shB2 exhibieron defectos marcados en la diferenciación del ectodermo (pax6 y NeuroD) y, en menor medida, en la diferenciación del mesodermo (CD34) cuando se analizaron utilizando el método spin EB en condiciones de diferenciación espontánea o de diferenciación de mesodermo dirigida, respectivamente. En conjunto, nuestros resultados muestran que antagonizar el eje de señalización ephrinB2 puede afectar la pluripotencia de las hESC, específicamente con respecto a la diferenciación de ectodermo y mesodermo. Curiosamente, antagonizar físicamente la señalización de ephrinB2 en trans (a través de la unión de sNiV-G secretada a ephrinB2) y eliminar la expresión de ephrinB2 en cis (a través de la disminución mediada por shB2 en el ARNm de ephrinB2) parece revelar las diferentes funciones que el eje de señalización de ephrinB2 puede desempeñar en el ectodermo y diferenciación del mesendodermo. En el año 3, caracterizamos la autorrenovación, la supervivencia y la pluripotencia de las hESC shB2 y shNT H9 clasificadas (shNT es un shRNA no dirigido que se utiliza como control de comparación para shB2). Las células parentales H9, shNT y shB2 H9 no mostraron diferencias significativas en los ensayos de autorrenovación durante 5 pases (datos no mostrados). Los ensayos de formación de teratoma in vivo no demostraron diferencias cualitativas obvias en la pluripotencia, ya que se observaron las tres capas germinales en cada línea hESC H9. Sin embargo, los ensayos de formación de teratoma in vivo son inherentemente variables y no se pueden modificar para una fácil cuantificación. Para abordar el impacto del antagonismo de ephrinB2 en la especificación de la capa germinal de una manera más cuantitativa y holística, realizamos micromatrices en hESC H9, shNT y shB2, y en sus EB derivados (días 6 y 13) en condiciones de diferenciación espontánea y comparamos su global. perfiles de expresión genética. Nuestro análisis reveló que un número progresivamente mayor de genes estaban específicamente regulados hacia arriba o hacia abajo en las células shEFNB2 en comparación con las células H9 y shNT en los días 0, 6 y 13, respectivamente. Análisis adicionales indicaron que la eliminación de ephrinB2 en hESC H9 puede mejorar la formación de progenitores de mesoendoermo al tiempo que inhibe la diferenciación de linajes de neuroectodermo. Finalmente, los ensayos de diferenciación dirigidos por mesodermo funcional revelaron que las hESC shEFNB2 tienen una mayor propensión a diferenciarse en un subtipo específico de células mesenquimales. En resumen, los hallazgos de esta tesis sugieren que la heterogeneidad de la expresión de ephrinB2 y la perturbación de la señalización de ephrinB2 pueden manipularse para mejorar la diferenciación dirigida de hESC in vitro.