Ingeniería de aloinjertos de células madre embrionarias para lograr tolerancia operativa

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Detalles de la concesión de la subvención

Tipo de subvención:

Inmunología de trasplantes

Conceder número:

RM1-01706

Investigador(es):

Nombre:

Profesor Christopher H. Contag

Institución:

Universidad de Stanford

Tipo:

Uso de células madre humanas:

Célula madre adulta o de tejido, Célula IPS

Generación de líneas celulares:

Célula madre adulta o de tejido, Célula IPS

Valor del premio:

$1,411,338

Estatus

Cerrado

Informe de progreso

Período de información:

Los estudiantes de Year 1

El potencial de las terapias con células madre es extraordinario; sin embargo, la implementación exitosa de dichas terapias requerirá una comprensión del reconocimiento inmunológico del tejido regenerado y la identificación de agentes terapéuticos que puedan modular el sistema inmunológico y prevenir el rechazo. Nos hemos propuesto identificar las redes de genes en células de mamíferos que pueden proteger las células embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) inmunológicamente no coincidentes del rechazo del injerto para avanzar en los esfuerzos para inducir tolerancia operativa hacia las células y tejidos trasplantados. Nuestra plataforma de análisis genético rápido permite estudiar el genoma del ratón in vivo sobreexpresando o silenciando genes únicos, múltiples o bibliotecas en células madre y sus derivados, y analizando su fenotipo in vivo resultante, es decir, su protección sostenida contra el rechazo inmunológico. Para ello, transferimos de forma estable genes de interés (para selección positiva) o ARN reguladores (para selección negativa), así como un casete que expresa luciferasa, a células ES o sus derivados, o a una línea celular tumoral que sirve como sustituto. trasplantes. El gen de la luciferasa proporciona una lectura inmediata para seguir las células modificadas después del trasplante en ratones receptores no coincidentes, ya que la supervivencia de las células se puede evaluar en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI). El primer conjunto de genes inmunomoduladores que hemos probado contiene inmunomoduladores clave: interleucina 4, factor de crecimiento transformante beta 1, factor 1 derivado del estroma e indolamina desoxigenasa -1. Hemos transferido ADNc murino que codifica estas proteínas a una línea celular de fibrosarcoma bioluminiscente, que utilizamos como sustituto de derivados de células madre diferenciadas. Cuando las células de fibrosarcoma modificadas que sobreexpresan uno de cada uno de estos genes se inyectaron en el músculo de ratones alogénicos, observamos una pequeña extensión del tiempo de supervivencia en las células que expresan TGF-β o IL-4 murina. Concluimos que, si bien esto es prometedor, para lograr una protección a largo plazo contra el rechazo de aloinjertos será necesaria una combinación de varios genes. Por lo tanto, en el año 02 a) ampliaremos la cantidad de genes que se analizarán en este sistema y probaremos combinaciones de genes. En el año 03, probaremos bibliotecas de genes inmunomoduladores y ARN reguladores para llegar a un conjunto mínimo de genes inmunomoduladores que puedan proteger con éxito las células madre y sus derivados del rechazo inmunológico durante períodos prolongados.

Período de información:

Los estudiantes de Year 2

Nuestro objetivo es proteger las células madre embrionarias (ES) y pluripotentes inducidas (iPS), y sus derivados, del rechazo de aloinjertos mediante modificación genética. Para ello, buscamos identificar un conjunto mínimo de genes inmunomoduladores que puedan proteger dichas células después del alotrasplante. Nuestra búsqueda emplea una transferencia rápida de genes y una plataforma de análisis in vivo, con la que sobreexpresamos o silenciamos bibliotecas únicas, múltiples o de genes en células madre y otras células a trasplantar. Tras la transferencia de las células a ratones inmunogenéticamente no coincidentes, podemos determinar el fenotipo in vivo de las células mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI), es decir, si están protegidas o no del rechazo inmunológico durante un período de tiempo sostenido. En el año 01, probamos cuatro genes murinos inmunomoduladores individualmente (IL-4, TGF-β1, SDF1 e IDO-1) y no encontramos ningún efecto protector significativo. En el año 02, examinamos combinaciones de dos genes por célula utilizando un conjunto de ocho genes, es decir, agregando IL-10, IL-1βRA, CCL21 y CD47. Para ello, hemos clonado sus ADNc en dos vectores transposones con distintos marcadores de resistencia a antibióticos. Estos vectores se transfirieron a células de fibroblastos NIH3T3, que sirven como sustitutos del trasplante, y la expresión génica se confirmó mediante qRT-PCR. Cuando las células de fibroblastos modificados que expresaban combinaciones de genes duales de los ocho genes, o todos menos uno, se inyectaron por vía subcutánea en ratones alogénicos, observamos que un gen, IL-4, tenía un efecto pequeño, pero estadísticamente significativo, en la supervivencia de las células. . Los fibroblastos transformados con oncogenes de control mostraron una bioluminiscencia prolongada debido a su proliferación inicialmente aumentada, pero finalmente también fueron rechazados. En el año 03, avanzaremos en esta evaluación a una mayor complejidad, ampliaremos la cantidad de ADNc que se analizarán y probaremos tres y cuatro combinaciones de genes. Al mismo tiempo, para identificar subpoblaciones de células inmunes particulares críticas para el rechazo, desafiaremos a ratones parcialmente inmunodeficientes con células que contienen dos y tres combinaciones de genes. También probaremos bibliotecas de shRNA y/o miRNA, y un transposón knockdown para una detección de genes de pérdida de función. Finalmente, una vez que lleguemos a un conjunto mínimo de genes inmunoprotectores analizaremos su efecto sobre la expresión génica celular mediante análisis de microarrays y luminex, y su efecto sobre las células inmunes en el microambiente mediante citometría de flujo.

Período de información:

Año 3 + NCE

El objetivo de nuestra subvención ha sido identificar un conjunto mínimo de genes inmunomoduladores que puedan proteger las células madre embrionarias (ES) y pluripotentes inducidas (iPS), y sus derivados, del rechazo de aloinjertos. Para cumplir este objetivo hemos desarrollado una plataforma de análisis y transferencia rápida de genes utilizando transposones diseñados, con los que hemos sobreexpresado genes individuales y múltiples en células murinas. Tras la transferencia adoptiva a ratones inmunogenéticamente no coincidentes, hemos determinado el efecto de estos genes en la supervivencia de las células no coincidentes a lo largo del tiempo utilizando imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI). En el año 1, no encontramos ningún efecto protector de cuatro genes murinos inmunomoduladores transferidos individualmente (IL-4, TGF-β1, SDF1 e IDO-1) a células no coincidentes. En el año 02, probamos combinaciones de genes dobles de un conjunto ampliado de genes, es decir, IL-4, IL-10, TGF-β1, IL-1βRA, SDF1, CCL21, IDO-1 y CD47 transferidos mediante dos transposones con distintos marcadores de resistencia a los antibióticos en una línea celular de fibroblastos bioluminiscentes que sirve como sustituto del trasplante. Cuando se inyectaron sc en ratones alogénicos células de fibroblastos que expresaban combinaciones de genes duales de todos los genes, o todos menos uno, no observamos, nuevamente, ningún efecto significativo sobre la supervivencia de las células. Sólo los fibroblastos transformados con oncogenes de control permanecieron durante una bioluminiscencia prolongada debido a una mayor proliferación, pero finalmente también fueron rechazados. En el año 03, ampliamos aún más el número de ADNc clonados en este sistema a veinte genes (agregando Timp3, FasL, B7-H1, B7-H4, Galectina-1). In vivo, probamos una combinación de 14 genes administrados por tres transposones. Este conjunto prolongó significativamente la supervivencia de los fibroblastos trasplantados (p=0.0068); sin embargo, las células aún fueron rechazadas en dos o tres semanas. Si bien esto sugiere un efecto inhibidor sobre la respuesta inmune innata a los injertos no coincidentes, se necesita más investigación para llegar a hallazgos que tengan un impacto en la aplicación clínica de células madre no coincidentes y sus derivados.

Detalles de la solicitud de subvención

Titulo de la aplicación:

Ingeniería de aloinjertos de células madre embrionarias para lograr tolerancia operativa

Resumen público:

Las células madre, como todos los trasplantes que no se derivan de un gemelo idéntico, están sujetas al escrutinio del sistema inmunológico y, sin intervenciones médicas que supriman el sistema inmunológico, generalmente mueren después del trasplante. Sin embargo, existen raras excepciones a esta regla porque una pequeña fracción de pacientes trasplantados ha podido mantener su trasplante en ausencia de terapia con medicamentos inmunosupresores y ha desarrollado "tolerancia operativa" hacia el injerto extraño. Nuestro equipo ha estudiado exhaustivamente a estos pacientes e identificado una serie de genes que característicamente se sobreexpresan o silencian en estos pacientes. Otros casos de tolerancia hacia células extrañas también ocurren de forma natural, por ejemplo durante el embarazo. Si bien se conocen numerosos genes que se correlacionan con la tolerancia operativa, no está tan claro si contribuyen activamente a la tolerancia y cómo se comparan en su eficacia. Por lo tanto, transferiremos esta colección de genes, uno por uno o como combinaciones, a células madre embrionarias de ratón utilizando métodos de terapia génica e identificaremos aquellos genes que pueden proteger mejor a las células del rechazo del sistema inmunológico.

Para controlar con precisión la supervivencia de las células madre trasplantadas en ratones a lo largo del tiempo, utilizaremos imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI). Para ello, etiquetamos las células madre con luciferasa, una proteína de la luciérnaga que emite luz. Estas células madre bioluminiscentes se trasplantan a ratones receptores (cuya luminiscencia de fondo es insignificante), donde las células se pueden visualizar de forma repetida y no invasiva con un sistema de cámara altamente sensible. Por lo tanto, la supervivencia, el crecimiento y la migración celular se pueden evaluar a lo largo del tiempo y en diversas condiciones, y podemos determinar si los genes introducidos afectan positiva o negativamente la supervivencia de los trasplantes de células madre, y cómo se comparan y, con suerte, cooperan.

Nuestros datos preliminares muestran que podemos detectar diferencias en la supervivencia de este tipo de células diseñadas. Esto indica que los estudios propuestos lograrán prolongar la supervivencia de los trasplantes de células madre de ratón, y que estos estudios se aceleran enormemente mediante el uso de BLI y de métodos de transferencia de genes desarrollados durante los últimos años en nuestro y otros laboratorios. El impacto potencial de esta propuesta es sustancial, ya que completar con éxito los objetivos específicos será un paso importante hacia el reemplazo y la regeneración de tejidos utilizando células madre, y la primera demostración de una detección de genes multiplexados en ratones. Si los genes que modulan el sistema inmunológico localmente y protegen los trasplantes de células madre en ratones pueden trasladarse al paciente, por ejemplo desarrollarse en fármacos de molécula pequeña que sean seguros de administrar, es prometedor que podamos reducir los efectos adversos de la administración sistémica. medicamentos y prolongar la vida útil de los trasplantes de células madre y órganos sin necesidad de inmunosupresión crónica. Esto tendría un impacto sustancial en el manejo de una variedad de condiciones médicas.

Declaración de beneficio para California:

El Instituto de Medicina Regenerativa de California busca descubrir nuevos enfoques terapéuticos que utilicen células madre para una amplia gama de enfermedades y evaluarlas críticamente para los ciudadanos de California. Desafortunadamente, sin embargo, las células madre trasplantadas derivadas de donantes genéticamente no relacionados son reconocidas como extrañas por el sistema inmunológico del receptor y generalmente destruidas en un mes. Actualmente, la única opción de tratamiento para los trasplantes de órganos y células madre consiste en una terapia con medicamentos inmunosupresores que es costosa y, debido a sus efectos sistémicos e inespecíficos, conlleva riesgos sustanciales de infección y cáncer. Sin embargo, la tolerancia a los tejidos extraños puede desarrollarse de forma natural, por ejemplo, en mujeres durante el embarazo donde se tolera el feto parcialmente no compatible, y en pacientes raros que tienen la suerte de mantener sus injertos no compatibles en ausencia de terapia con medicamentos inmunosupresores. Es de estos casos, que nuestro grupo ha estudiado ampliamente, que tomaremos nuestras pistas para desarrollar una comprensión integral de la tolerancia a los trasplantes y su base genética. Porque sin esto y sin un medio eficaz para transferir esta tolerancia a las células madre, es posible que no se realice el enorme potencial de las nuevas terapias con células madre. Incluso las terapias con células madre autólogas, en las que los pacientes reciben células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que se derivan de sus propias células y, por lo tanto, no coinciden, si tuvieran éxito, no beneficiarán a los pacientes con trastornos autoinmunes, como la diabetes tipo 1. que todavía reaccionará y destruirá cualquier tejido trasplantado. Por lo tanto, claramente se necesitan alternativas que modulen la respuesta inmune en el sitio de las células o tejidos injertados. Nuestro plan es seleccionar del genoma del ratón el conjunto de genes por excelencia cuya regulación positiva o negativa es necesaria y suficiente para la protección a largo plazo de los trasplantes de células madre en ratones genéticamente no compatibles. En este enfoque genético innovador e integral, modificaremos la expresión de genes individuales o grupos de genes en células madre de ratón y observaremos el destino de las células después del trasplante con potentes tecnologías de imágenes que no son invasivas y son altamente sensibles. Por tanto, el efecto de cada gen sobre la supervivencia de un trasplante de células madre puede medirse y evaluarse comparativamente fácilmente, así como examinarse la cooperatividad de cada gen con otros genes en la inducción de tolerancia. Adquirir este conocimiento genético y traducirlo en terapias efectivas con células madre para pacientes humanos serán los pasos críticos en una continuidad de investigación que claramente beneficiará a los ciudadanos de California y otros lugares. Porque hacer que el trasplante de células madre sea más eficiente y mejor tolerado no sólo hará avanzar los campos de la biología y la medicina de las células madre, sino también el del trasplante de órganos en general, de modo que en el futuro se incurrirá en menos sufrimiento y costos en términos de vidas y fondos perdidos.

Ingeniería de aloinjertos de células madre embrionarias para lograr tolerancia operativa

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