Ingeniería de un injerto de tejido cardiovascular a partir de células madre embrionarias humanas

Objetivo específico 1: Acondicionar electromecánicamente los cardiomiocitos derivados de hESC. Progreso: Durante el año pasado, diseñamos y construimos un sistema de estiramiento integrado controlado por computadora y un sistema de estimulación eléctrica para aplicar estimulación mecánica y eléctrica. Este sistema se utilizó junto con una matriz de microelectrodos estirables (sMEA) y se demostró que soporta, estira y estimula con éxito los cardiomiocitos murinos primarios (CM). También hemos desarrollado un dispositivo de matriz de cepas para cultivo celular que interconecta eficazmente las propiedades deseables de los dispositivos fluídicos a microescala de alto rendimiento con funciones fáciles de usar a macroescala. Un desafío que hemos encontrado con nuestros sMEA es mantener la continuidad eléctrica de los electrodos a medida que se estiran las células. Como alternativa a la estimulación eléctrica tradicional, hemos creado un sistema que induce ópticamente la actividad eléctrica en hESC-CM. Ahora podemos marcar de forma óptica y no invasiva cardiomiocitos diferenciados de nuestra línea hESC modificada. Objetivo específico 2: diseñar un injerto de tejido cardiovascular basado en hESC-CM. Progreso: desde nuestro primer intento de diseñar un injerto de tejido cardiovascular, como informamos en el año 1, aprendimos que nuestros injertos requerirían grandes poblaciones de hESC-CM relativamente puras. Como resultado, concentramos nuestros esfuerzos durante el año pasado en desarrollar un método de diferenciación más eficiente para producir mayores rendimientos y cantidades de hESC-CM. Nuestro método produce hESC-CM de manera dirigida en condiciones sin alimentación ni suero mediante el control de múltiples vías de desarrollo cardiomiogénico. Además, en un esfuerzo de colaboración, estamos diseñando un método novedoso para clasificar cardiomiocitos. Para promover una mayor viabilidad de hESC-CM en nuestros injertos de tejido, probablemente será necesario el cotrasplante con células endoteliales derivadas de hESC (hESC-EC), a diferencia de VEGF solo, como lo han demostrado recientemente otros. Durante el año pasado, hemos demostrado que podemos producir hESC-EC y que su supervivencia en el corazón mejora mediante la activación de los receptores de acetilcolina que conducen a la activación de vías de supervivencia y antiapoptosis. Finalmente, para controlar la orientación espacial de hESC-CM dentro de nuestros injertos de tejido, hemos demostrado micropatrones bajo demanda de proteínas de matriz para la localización celular y la determinación del destino de las células madre. Hemos ilustrado la utilidad de una tecnología de impresión de nanocontacto basada en voladizo para patrones celulares, renovación de mESC y especificación del destino de mESC. Actualmente estamos ampliando nuestros resultados a hESC y hESC-CM indiferenciados. Objetivo específico 3: evaluar la viabilidad y función del injerto de tejido en un modelo de animal pequeño. Progreso: Durante el año pasado, creamos injertos de tejido basados ​​en hESC-CM en forma lineal. Para cuantificar la pérdida de función cardíaca entre corazones sanos y enfermos, recientemente hemos desarrollado un novedoso sistema híbrido experimental/computacional in vitro para medir la generación de fuerza activa en cortes ventriculares de corazones de roedores. La cuantificación de la pérdida de función cardíaca nos guiará para determinar la cantidad de hESC-CM necesarias para producir injertos con capacidad de generación de fuerza variable. Finalmente, como se describe en nuestra propuesta original, primero implantaremos nuestros injertos de tejido en aortas de rata como un nuevo banco de pruebas para evaluar la función inherente del injerto y al mismo tiempo minimizar los efectos de confusión de las contracciones cardíacas subyacentes. Durante el año pasado, implantamos con éxito parches aórticos descelularizados en aortas de ratas y actualmente estamos trabajando para agregar hESC-CM y hESC-EC a los parches para evaluar su viabilidad y función. En resumen, en el segundo año de nuestro proyecto hemos logrado grandes avances en nuestros tres objetivos específicos. Basándonos en nuestros resultados actuales, prevemos que seguiremos logrando avances significativos en la ingeniería de un injerto de tejido cardiovascular robusto y funcional.

Objetivo específico 1: Acondicionar electromecánicamente los cardiomiocitos (CM) derivados de hESC. Progreso: Durante el año pasado, probamos, validamos y publicamos un sistema integrado de estimulación eléctrica y tensión que diseñamos y construimos. Como mencionamos en nuestros informes anteriores, un desafío que encontramos con nuestros dispositivos electromecánicos es mantener la continuidad eléctrica de los electrodos a medida que se estiran las células. Como alternativa a la estimulación eléctrica tradicional, con colaboradores de Stanford, hemos creado un sistema que induce ópticamente la actividad eléctrica en hESC-CM mediante la introducción de canalrodopsina-2 (ChR2) activada por luz, un canal catiónico, en hESC indiferenciadas. En nuestro manuscrito inicial también demostramos los efectos de la estimulación lumínica en un modelo computacional de corazón completo en el que virtualmente inyectamos hESC-CM sensible a la luz en varias áreas del corazón simulado. Objetivo específico 2: diseñar un injerto de tejido cardiovascular basado en hESC-CM. Progreso: desde nuestro primer intento de diseñar un injerto de tejido cardiovascular, como informamos en los años 1, 2 y 3, aprendimos que nuestros injertos requerirían grandes poblaciones de hESC-CM relativamente puras. Como resultado, hemos continuado nuestros esfuerzos para desarrollar un método de diferenciación más eficiente para producir mayores rendimientos y cantidades de hESC-CM. Nuestro método produce hESC-CM e iPSC-CM de manera dirigida en condiciones de monocapa, sin suero y sin alimentación mediante el control de las vías TGF-beta/Activina, BMP, Wnt y FGF. Hemos utilizado nuestros protocolos de diferenciación para aportar cardiomiocitos a nuestros colaboradores, lo que ha dado como resultado un manuscrito publicado y dos publicaciones enviadas. Además, con nuestro colaborador en UC Berkeley, hemos diseñado un método novedoso para identificar CM en función de sus señales eléctricas y hemos informado de nuestra tecnología en un manuscrito aceptado y otro en revisión. Objetivo específico 3: evaluar la viabilidad y función del injerto de tejido en un modelo de animal pequeño. Progreso: durante los últimos dos años, creamos injertos de tejido basados ​​en hESC-CM en formas lineales y circulares y ahora estamos creando injertos que se pueden controlar ópticamente (ver Objetivo 1 arriba). Como se describe en nuestro último informe de progreso, para cuantificar la pérdida de función cardíaca entre corazones sanos y enfermos, hemos presentado un nuevo sistema híbrido experimental/computacional in vitro para medir la generación de fuerza activa en cortes ventriculares sanos de corazones de roedores. La cuantificación de la pérdida de función cardíaca nos guiará para determinar la cantidad de hESC-CM necesarias para producir injertos con capacidad de generación de fuerza variable. También hemos modelado el crecimiento cardíaco excéntrico y concéntrico mediante sarcomerogénesis para darnos una idea de cómo podríamos madurar terminalmente nuestros injertos hESC-CM. Finalmente, hemos diferenciado hESC en CM para uno de nuestros colaboradores en Stanford y hemos realizado imágenes detalladas de calcio para mostrar el injerto de hESC-CM con tejido cardíaco humano. Esto nos ha dado una gran idea de cómo los injertos de tejido 3D podrían integrarse con el tejido del corazón humano. En resumen, en el cuarto año de nuestro proyecto logramos buenos avances en nuestros tres objetivos específicos. Con base en nuestros resultados actuales, anticipamos que continuaremos logrando avances significativos en la ingeniería de un injerto de tejido cardiovascular robusto y funcional como propusimos originalmente y continuaremos con nuestros esfuerzos. Sin lugar a dudas, con el apoyo de la subvención del CIRM durante los últimos cuatro años, hemos logrado grandes avances hacia la creación de un injerto de tejido 3D y creemos que demostraremos una integración funcional, no solo con corazones de roedores, sino también con tejido humano, todo ello durante el próximo año.