El objetivo de este proyecto es desarrollar una terapia con células madre que mejorará la condición médica de los pacientes con distrofia muscular de cinturas tipo 2B. En esta enfermedad, los pacientes tienen una mutación en cada copia de su gen que codifica la disferlina. Dysferlin es una proteína que se expresa principalmente en el músculo, donde parece ayudar en la reparación de las células musculares. Cuando falta la proteína, las fibras musculares se debilitan y se descomponen gradualmente. Los pacientes pierden fuerza muscular y se vuelven dependientes de una silla de ruedas para moverse. En nuestra estrategia, comenzamos con células del paciente, para que sean inmunológicamente compatibles. Al introducir transitoriamente varios genes que “reprograman” las células, las células del paciente se convierten en células madre pluripotentes inducidas (IPSC), que tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula del cuerpo. El siguiente paso es corregir la mutación en la disferlina, de modo que las células produzcan la proteína disferlina. Luego, las células se diferencian en células precursoras musculares y se trasplantan al cuerpo, donde pueden reparar el tejido muscular defectuoso. Durante el primer año del proyecto, hemos avanzado en el desarrollo de cada paso de esta estrategia. Obtuvimos iPSC derivadas de las células de un paciente LGMD2B. Para corregir la mutación en disferlina, aplicamos una nueva tecnología de edición del genoma llamada CRISPR/Cas9. Para utilizar esta tecnología, diseñamos dos moléculas de ARN que reconocerían secuencias de ADN cercanas a la mutación. También diseñamos una secuencia de ADN que coincidía con el área de la mutación, pero contenía la secuencia de ADN correcta en lugar de la secuencia mutada. Después de introducir estas tres moléculas en la iPSC del paciente, las células utilizaron la información genética introducida para corregir precisamente la mutación. Verificamos que se produjo la corrección deseada en la iPSC del paciente y estamos aislando clones de iPSC individuales que portan la secuencia de ADN correcta en lugar de la mutación. Verificaremos que las iPSC ahora produzcan proteína disferlina. Para convertir las iPSC en células precursoras musculares para trasplante, aplicamos un método de cultivo celular que incluía la adición de tres pequeñas moléculas que estimulan a las iPSC a convertirse en células musculares. Verificamos que este procedimiento fue efectivo para crear precursores musculares que luego se fusionaron en células musculares en cultivo celular en el plazo de un mes. Estamos probando estas células en varios momentos en experimentos de trasplante que implican inyectar las células en los músculos del ratón. Dado que estamos colocando células humanas en un ratón, para evitar el rechazo inmunológico de las células, primero creamos una nueva cepa de ratón cruzando un modelo de ratón de LGMD2B con ratones con inmunodeficiencia grave. Los ratones resultantes, que ya están listos para su uso, servirán como receptores en nuestros experimentos de trasplante. Analizaremos los músculos trasplantados para ver si contienen las células que trasplantamos. Las células trasplantadas pueden incorporarse a las fibras musculares existentes mediante fusión, produciendo fibras musculares más fuertes. Analizaremos la presencia de células trasplantadas mediante tinción de la proteína disferlina en los músculos receptores. Además, estamos probando el potencial de las células trasplantadas para convertirse en células madre funcionales dentro del músculo que puedan dar lugar a fibras musculares sanas a largo plazo. Estos tipos de células madre musculares se denominan células satélite. Para demostrar que las células madre de nuestro donante se han convertido en células satélite del músculo, lesionaremos el músculo e intentaremos detectar la regeneración derivada de las células del donante. También purificaremos las células satélite del músculo receptor y las trasplantaremos a otro animal, y mediremos si se produce regeneración muscular derivada del donante en el músculo receptor. Si es así, eso indicaría que nuestras células corregidas tienen capacidad regenerativa. Para evaluar si nuestras células trasplantadas provocan una mejora en la fuerza muscular, estamos utilizando un ensayo sensible para medir la cantidad de fuerza que puede generar un músculo en particular. Hemos estado colaborando con otro laboratorio para aplicar este método y planeamos usarlo para ver si podemos detectar una mejora en la fuerza muscular resultante de las células madre trasplantadas. Si las iPSC corregidas muestran capacidad regenerativa en el músculo receptor y pueden mejorar la fuerza del músculo, estas características proporcionarían una prueba de principio para una terapia eficaz con células madre para LGMD2B.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
El objetivo de este proyecto es desarrollar una terapia con células madre que mejorará la condición médica de los pacientes con distrofia muscular de cinturas tipo 2B. En esta enfermedad, los pacientes tienen una mutación en cada copia de su gen que codifica la disferlina. Dysferlin es una proteína que se expresa principalmente en el músculo, donde tiene un papel importante en la reparación de las células musculares. Cuando falta la proteína, las fibras musculares se debilitan y se descomponen gradualmente. Los pacientes pierden fuerza muscular y se vuelven dependientes de una silla de ruedas para moverse. En nuestra estrategia, comenzamos con células del paciente, para que sean inmunológicamente compatibles. Las células son “reprogramadas” en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula. El siguiente paso es corregir la mutación en la disferlina, de modo que las iPSC produzcan la proteína disferlina. Luego, las células se diferencian en células precursoras musculares y se trasplantan al cuerpo, donde pueden reparar el tejido muscular defectuoso. Durante el segundo año del proyecto, hemos avanzado en el desarrollo de cada paso de esta estrategia. Anteriormente obtuvimos iPSC derivadas de las células de un paciente LGMD2B. Para corregir la mutación en disferlina, aplicamos una tecnología de edición del genoma llamada CRISPR/Cas9. Para utilizar esta tecnología, diseñamos una molécula de ARN que reconocía secuencias de ADN cercanas a la mutación. También diseñamos una secuencia de ADN que coincidía con el área de la mutación, pero contenía la secuencia de ADN correcta en lugar de la secuencia mutada. Después de introducir estas moléculas en las iPSC del paciente, las células utilizaron la información genética introducida para corregir precisamente la mutación. Aislamos clones de iPSC que portaban la secuencia de ADN correcta en lugar de la mutación. Utilizando dos técnicas diferentes que miden la cantidad de disferlina producida por las células, verificamos que después de la diferenciación en precursores musculares, las iPSC corregidas ahora producían proteína disferlina en cantidades similares a las células normales. Para convertir las iPSC en células precursoras musculares para trasplante, aplicamos un método de cultivo celular que incluía la adición de tres pequeñas moléculas que estimulaban a las iPSC a convertirse en células musculares. Comprobamos que este procedimiento era eficaz para crear células precursoras musculares. El método hizo que las iPSC comenzaran a expresar varias proteínas características de las células madre musculares. Estas proteínas incluían PAX7 y CD56. A los 21 días de diferenciación, la mayoría de las células expresaban estos marcadores. Las células diferenciadas también se fusionaron en células musculares en un cultivo celular en el plazo de un mes. Probamos estas células en experimentos de trasplante que implicaron inyectar las células en músculos de ratones. Dado que estábamos colocando células humanas en un ratón, para evitar el rechazo inmunológico de las células, primero creamos una nueva cepa de ratón cruzando un modelo de ratón de LGMD2B con ratones con inmunodeficiencia grave. Los ratones resultantes sirven como receptores en nuestros experimentos de trasplante. Las células trasplantadas pueden incorporarse a las fibras musculares existentes mediante fusión, produciendo fibras musculares más fuertes. Analizamos los músculos trasplantados para ver si contenían las células que inyectamos. Detectamos la presencia de células trasplantadas mediante tinción de proteínas humanas específicas en los músculos receptores que identificaron que las células derivaban de las células del donante que inyectamos. Para distribuir ampliamente las células musculares corregidas en los músculos grandes de pacientes humanos, desarrollamos métodos mediante los cuales podíamos inyectar las células en una arteria y permitir que se distribuyeran en los músculos a través del torrente sanguíneo. Para realizar este ensayo, preparamos células madre musculares y luego las inyectamos en la arteria femoral de un modelo de ratón. Como los ratones son pequeños, este procedimiento debe realizarse bajo un microscopio de baja potencia. Las células del donante se marcaron con varios marcadores para poder rastrearlas en los animales receptores. Al analizar la presencia de estos marcadores en los músculos de los animales receptores, demostramos que las células de nuestro donante se habían injertado en todos los músculos de las piernas que examinamos. Creemos que este tipo de método, basado en inyección vascular, será valioso para la entrega de células terapéuticas a los músculos. Para evaluar si nuestras células trasplantadas causan una mejora en la fuerza muscular, estamos desarrollando ensayos para medir la diferencia entre ratones normales y nuestros modelos de ratón con distrofia muscular de cinturas 2B. Los ensayos que estamos desarrollando incluyen un ensayo en cinta rodante para medir cuánto tiempo pueden correr los ratones, como medida de la fuerza muscular. También estamos midiendo las diferencias dentro de los músculos que son indicadores de si el músculo está sano o enfermo. Si las iPSC corregidas pueden mejorar la fuerza y la salud de los músculos de los ratones, estas características proporcionarían una prueba de principio para una terapia eficaz con células madre para LGMD2B.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
En este proyecto, desarrollamos un enfoque de terapia con células madre para tratar la distrofia muscular. El enfoque tuvo tres pasos. 1. En el primer paso, utilizamos células madre creadas a partir de tejidos de pacientes. Dado que la distrofia muscular es una enfermedad genética, primero tuvimos que corregir la mutación en las células madre del paciente. La corrección se realizó mediante el uso de varias técnicas de edición de genes que se han desarrollado en los últimos años. La corrección fue exitosa y el resultado fue que las células madre de los pacientes ahora portaban la versión correcta del gen que había sido mutado. 2. En el siguiente paso, cultivamos las células madre de manera que se diferenciaran en células que se parecían a las células madre musculares. Esta diferenciación se realizó exponiendo las células madre a varias moléculas pequeñas que provocaron la diferenciación. Las células madre diferenciadas parecían y actuaban como células madre musculares en una placa de cultivo. 3. El paso final fue reintroducir las células madre diferenciadas y corregidas nuevamente en el músculo, donde podrían llevar a cabo la reparación del tejido muscular en degeneración. Para este paso, utilizamos un modelo de ratón con distrofia muscular que tenía una enfermedad similar a la de los pacientes humanos. Los ratones se volvieron inmunodeficientes para que no rechazaran las células humanas inyectadas. Desarrollamos un procedimiento para introducir células madre humanas corregidas y diferenciadas en el músculo inyectando las células en el torrente sanguíneo, donde viajaron a todos los músculos de la extremidad trasera del ratón. Al llevar a cabo este procedimiento, obtuvimos el injerto de un número reducido de células donantes en los músculos del ratón. Si bien todo el procedimiento funcionó a nivel de prueba de principio, algunos aspectos del mismo requerían mucho tiempo, eran costosos, complicados e ineficientes. Ahora estamos buscando formas de mejorar el procedimiento para hacerlo más rápido, más barato y más eficaz.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
iPSC diseñado para el tratamiento de la distrofia muscular de cinturas tipo 2B
Resumen público:
La distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD 2B) es una forma de distrofia muscular que conduce a la degeneración muscular y la discapacidad. En LGMD 2B, una proteína muscular vital sufre una mutación y su ausencia conduce a una degeneración progresiva de los músculos del cuerpo que son necesarios para la movilidad. Para crear una terapia, proporcionaremos un nuevo suministro de células madre que transportan la proteína faltante. Estas células se entregarán al cuerpo de tal manera que se injertarán en los músculos y producirán tejido muscular nuevo y saludable de forma continua.
Ahora poseemos métodos para crear células madre que pueden convertirse en células musculares a partir de células de la piel adulta mediante un proceso conocido como "reprogramación". Al reprogramar células adultas, junto con la adición a ellas de una copia correcta del gen mutado en LGMD 2B, crearemos células madre que tienen la capacidad de crear células musculares nuevas y sanas en el cuerpo de un paciente. Este es el tipo de estrategia que estamos desarrollando en esta propuesta. Las células madre musculares corregidas se trasplantarán a ratones con LGMD 2B y se evaluará la capacidad de las células para generar tejido muscular nuevo y sano y aumentar la fuerza muscular.
Este proyecto podría conducir a una nueva terapia con células madre que podría mejorar la condición clínica de los pacientes con LGMD 2B. Si tenemos éxito con esta enfermedad, se podrían utilizar métodos similares para tratar otros trastornos degenerativos, y quizás incluso parte de la degeneración que se produce durante las lesiones musculares y el envejecimiento normal.
Declaración de beneficio para California:
La investigación propuesta podría conducir a una terapia con células madre para la distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD 2B). Este resultado brindaría una variedad de beneficios al estado de California. Habría un profundo beneficio personal para los californianos afectados directa o indirectamente por LGMD 2B. También es probable que el progreso hacia una cura para LGMD 2B acelere el desarrollo de tratamientos para otros trastornos degenerativos. Los objetivos más obvios serían otras formas de distrofia muscular y trastornos neuromusculares. Las lesiones musculares, e incluso algunos de los procesos normales del envejecimiento muscular, pueden tratarse mediante una estrategia similar. Una terapia eficaz con células madre para LGMD 2B también traería beneficios económicos al estado al reducir la enorme carga de costos asociados con la atención de pacientes con trastornos degenerativos a largo plazo. Muchos de estos pacientes estarían en mejores condiciones de contribuir a la fuerza laboral y pagar impuestos. Otro beneficio es el efecto de las tecnologías novedosas y de vanguardia desarrolladas en California en la economía empresarial del estado. Estas tecnologías pueden tener un efecto profundo en la competitividad de California a través de la formación de nuevas instalaciones de fabricación y prestación de atención médica que emplearían a ciudadanos de California y traerían nuevas fuentes de ingresos al estado. Por lo tanto, este proyecto tiene el potencial de traer beneficios económicos y de salud a California que son muy deseables para el estado.
