Esclarecimiento de la base molecular de la miocardiopatía hipertrófica con células madre pluripotentes inducidas por humanos

La miocardiopatía hipertrófica familiar (MCH) es la principal causa de muerte cardíaca súbita en jóvenes, incluidos los atletas entrenados, y es el defecto cardíaco hereditario más común. En esta propuesta, generaremos cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM) de pacientes con MCH. Los objetivos específicos son los siguientes: Objetivo específico 1: Generar iPSC de pacientes con MCH y controles sanos. Objetivo específico 2: determinar la extensión de la enfermedad mediante la realización de análisis moleculares y funcionales de hiPSC-CM. Objetivo específico 3: Rescatar los fenotipos moleculares y funcionales utilizando la tecnología de nucleasa de dedos de zinc (ZFN). Durante el año pasado, obtuvimos iPSC de una cohorte familiar de 10 pacientes con la mutación MYH7. Las líneas de iPSC establecidas de todos los sujetos se diferenciaron en linajes de cardiomiocitos (iPSC-CM) utilizando protocolos estándar de diferenciación de EB 3D. Encontramos que las iPSC-CM hipertróficas exhibían características de HCM, como agrandamiento celular y multinucleación, a partir de la sexta semana después de la inducción de la diferenciación cardíaca. También encontramos que las iPSC-CM hipertróficas demostraron otras características distintivas de la MCH, incluida la expresión del factor natriurético auricular (ANF), la elevación de la relación β-miosina/α-miosina, activación de calcineurina y translocación nuclear del factor nuclear de células T activadas (NFAT). como se detecta mediante inmunotinción. El bloqueo de la interacción calcineurina-NFAT en HCM iPSC-CM por ciclosporina A (CsA) y FK506 redujo la hipertrofia en más del 40%. En ausencia de inhibición, se encontró que los mediadores de hipertrofia activados por NFAT, como GATA4 y MEF2C, estaban significativamente regulados positivamente en HCM iPSC-CM a partir del día 40 después de la inducción de la diferenciación cardíaca, pero no antes de este punto. En conjunto, estos resultados indican que la señalización de calcineurina-NFAT juega un papel central en el desarrollo del fenotipo HCM causado por la mutación Arg663His.

La miocardiopatía hipertrófica familiar (MCH) es la principal causa de muerte cardíaca súbita en jóvenes, incluidos los atletas entrenados, y es el defecto cardíaco hereditario más común. En esta propuesta, generaremos y caracterizaremos cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM) de pacientes con MCH. Los objetivos específicos son los siguientes: Objetivo específico 1: Generar iPSC de pacientes con MCH y controles sanos. Objetivo específico 2: determinar la extensión de la enfermedad mediante la realización de análisis moleculares y funcionales de hiPSC-CM. Objetivo específico 3: Rescatar los fenotipos moleculares y funcionales utilizando la tecnología de nucleasa de dedos de zinc (ZFN). Durante el año pasado, caracterizamos los fenotipos patológicos de las iPSC derivadas de una cohorte familiar de 10 pacientes con la mutación MYH7. Hemos diferenciado todas las líneas iPSC establecidas de todos los sujetos en cardiomiocitos utilizando un protocolo modificado del publicado por Palacek en PNAS 2011. Este protocolo aumentó significativamente el rendimiento de cardiomiocitos a más del 70 % de los cardiomiocitos. Luego probamos las propiedades electrofisiológicas de las iPSC-CM del control y de los pacientes con MCH y descubrimos que tanto el control como las iPSC-CM del paciente muestran formas de ondas eléctricas auriculares, ventriculares y nodales mediante el pinzamiento del parche de células completas. Sin embargo, para el día 30, una gran subfracción (~40%) del HCM iPSC-CM exhibe formas de onda arrítmicas que incluyen posdespolarizaciones retardadas (DAD) en comparación con el control (~5.1%). Además, encontramos que el tratamiento de HCM hiPSC-CM con agentes inotrópicos positivos (agonista beta-adrenérgico - isoproterenal) durante 5 días provocó un aumento más temprano en el tamaño de las células de 1.7 veces en comparación con los controles y un aumento significativo en los transitorios irregulares de calcio. Además, encontramos que los HCM iPSC-CM exhibieron arritmia frecuente debido a su aumento del nivel de calcio intracelular en un 30% al inicio del estudio. Estos HCM iPSC-CM también mostraron una disminución de la liberación de calcio por parte del retículo sarcoplásmico. Estos hallazgos enfatizan el papel del reciclaje irregular de calcio en la patogénesis de la MCH. Para confirmar que la regulación del calcio de los miocitos es la clave para la patogénesis de la MCH, tratamos varias líneas de múltiples pacientes con MCH con un bloqueador de los canales de calcio (verapamilo/diltiazem) y descubrimos que este tratamiento mejoró significativamente todos los aspectos del fenotipo de la MCH, incluida la hipertrofia de los miocitos, el calcio. manejo de anomalías y arritmias. Estos hallazgos respaldan el uso de bloqueadores de los canales de calcio en pacientes con MCH y alientan a realizar más estudios clínicos en pacientes con MCH que utilicen estos agentes.

La miocardiopatía hipertrófica familiar (MCH) es la principal causa de muerte cardíaca súbita en jóvenes, incluidos los atletas entrenados, y es el defecto cardíaco hereditario más común. En esta propuesta, generaremos cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-CM) de pacientes con MCH. Los objetivos específicos son los siguientes: Objetivo específico 1: Generar iPSC de pacientes con MCH y controles sanos. Objetivo específico 2: determinar la extensión de la enfermedad mediante la realización de análisis moleculares y funcionales de hiPSC-CM. Objetivo específico 3: Rescatar los fenotipos moleculares y funcionales utilizando la tecnología de nucleasa de dedos de zinc (ZFN). Durante el año pasado, caracterizamos las iPSC-CM de una cohorte familiar de 10 pacientes con la mutación MYH7 utilizando protocolos estándar de diferenciación EB 3D. Descubrimos que las iPSC-CM normales e hipertróficas eran predictivas como modelo in vitro para la detección de arritmias mediante microelectroarrays y análisis de fijación de parches unicelulares. Por ejemplo, descubrimos que la administración de norepinefrina, un fármaco catecolamínico, provoca la formación de torsade de point, que es una arritmia letana. Esto recapitula el fenotipo en pacientes con MCH que reciben catecolaminas. También encontramos un aumento en la formación de torsades cuando las iPSC-CM se tratan con bloqueadores de hERG que también se sabe que causan aumentos en la arritmia en pacientes con MCH. Creemos que el uso de hiPSC-CM de individuos sanos y pacientes con enfermedad cardíaca genética puede ayudar a predecir el riesgo potencial de arritmia en agentes farmacológicos nuevos o existentes que están siendo evaluados por la FDA. También hemos generado mutaciones de HCM en líneas de iPSC normales para determinar si estas líneas mutantes exhibirán fenotipo de HCM. Esto satisfacería el postulado de Koch con respecto al papel de la secuencia de ADN mutante en la manifestación de la MCH. Descubrimos, utilizando las tecnologías de transposones TALEN y piggyBac, que se puede generar un genoma editado para portar la mutación R663H en el gen MYH7 y que estos iPSC-CM editados con genoma recapitulan el fenotipo HCM asociado con la mutación R663H, como el desensamblaje del sarcómero y las anomalías del calcio intracelular. como arritmias contráctiles. También hemos corregido iPSC humana HCM mutante de pacientes con mutación MYH7 R663H y mostramos que estas iPSC-CM corregidas exhiben un fenotipo sarcomérico normal con un tamaño celular más pequeño e irregularidades transitorias de calcio reducidas.