Evolución dirigida de nuevas variantes de AAV para una mejor orientación genética en células madre humanas pluripotentes e investigación de la diferenciación de neuronas dopaminérgicas
Detalles de la concesión de la subvención
Tipo de subvención:
Conceder número:
RT1-01021
Investigador(es):
Enfoque de la enfermedad:
Uso de células madre humanas:
Generación de líneas celulares:
Valor del premio:
$918,000
Estatus
Cerrado
Informe de progreso
Período de información:
Los estudiantes de Year 1
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Período de información:
NCE
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Evolución dirigida de nuevas variantes de AAV para una mejor orientación genética en células madre humanas pluripotentes e investigación de la diferenciación de neuronas dopaminérgicas
Resumen público:
Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) tienen un potencial considerable como fuentes de células diferenciadas para numerosas aplicaciones biomédicas. La capacidad de introducir cambios específicos en el ADN de estas células (un proceso conocido como selección genética) tendría implicaciones muy amplias. Por ejemplo, se podrían introducir fácilmente mutaciones en genes para estudiar su papel en la propagación y diferenciación de células madre, analizar mecanismos de enfermedades humanas y desarrollar modelos de enfermedades que ayuden a crear nuevas terapias. Desafortunadamente, la eficiencia de la selección de genes en hESC es muy baja. Para satisfacer esta necesidad urgente, proponemos desarrollar nuevas herramientas moleculares y tecnologías novedosas para la focalización de genes de alta eficiencia en células hES e iPS. Es importante destacar que este enfoque se combinará con la identificación de todo el genoma y el análisis funcional de los genes implicados en el proceso de desarrollo de las neuronas dopaminérgicas, un trabajo con implicaciones fundamentales para la enfermedad de Parkinson.
Las barreras a la modificación genética dirigida incluyen la administración efectiva de construcciones dirigidas a genes en las células y la introducción de cambios definidos en el genoma. Hemos desarrollado un enfoque de alto rendimiento para diseñar propiedades novedosas en un vehículo de administración de genes altamente prometedor, seguro y clínicamente relevante. Por ejemplo, hemos diseñado variantes de este vehículo con una entrega de genes altamente eficiente a las células madre neurales (NSC), y los vehículos resultantes pueden mediar en la selección eficiente de genes. Ahora proponemos diseñar nuevos vehículos de administración y orientación de genes optimizados para su uso en hESC y células iPS. Una aplicación de este sistema vectorial mejorado será estudiar el mecanismo de diferenciación de ESC en neuronas dopaminérgicas con la ayuda del factor de transcripción clave Lmx1a. Proponemos identificar genes diana que están regulados por Lmx1a durante la diferenciación de neuronas dopaminérgicas utilizando la técnica recientemente desarrollada de ChIP-seq, en combinación con expresión de ARN y análisis bioinformático. Este trabajo identificará genes de control esenciales que impulsan la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas. Además, nuestro sistema mejorado de administración y direccionamiento de genes se utilizará para sobreexpresar genes candidatos, anularlos mediante interferencia de ARN e incorporar genes informadores para analizar las redes de expresión génica durante la diferenciación neuronal.
La generación de tecnologías de focalización eficientes, en combinación con el análisis de todo el genoma de las redes de regulación genética, proporcionará un método general para identificar y probar genes reguladores clave para la autorrenovación y diferenciación de las células madre, así como para generar modelos de células madre de humanos. enfermedad. Por lo tanto, esta combinación de bioingeniería y biología celular tiene un gran potencial para crear una nueva e importante capacidad para la investigación básica y aplicada con células madre.
Las barreras a la modificación genética dirigida incluyen la administración efectiva de construcciones dirigidas a genes en las células y la introducción de cambios definidos en el genoma. Hemos desarrollado un enfoque de alto rendimiento para diseñar propiedades novedosas en un vehículo de administración de genes altamente prometedor, seguro y clínicamente relevante. Por ejemplo, hemos diseñado variantes de este vehículo con una entrega de genes altamente eficiente a las células madre neurales (NSC), y los vehículos resultantes pueden mediar en la selección eficiente de genes. Ahora proponemos diseñar nuevos vehículos de administración y orientación de genes optimizados para su uso en hESC y células iPS. Una aplicación de este sistema vectorial mejorado será estudiar el mecanismo de diferenciación de ESC en neuronas dopaminérgicas con la ayuda del factor de transcripción clave Lmx1a. Proponemos identificar genes diana que están regulados por Lmx1a durante la diferenciación de neuronas dopaminérgicas utilizando la técnica recientemente desarrollada de ChIP-seq, en combinación con expresión de ARN y análisis bioinformático. Este trabajo identificará genes de control esenciales que impulsan la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas. Además, nuestro sistema mejorado de administración y direccionamiento de genes se utilizará para sobreexpresar genes candidatos, anularlos mediante interferencia de ARN e incorporar genes informadores para analizar las redes de expresión génica durante la diferenciación neuronal.
La generación de tecnologías de focalización eficientes, en combinación con el análisis de todo el genoma de las redes de regulación genética, proporcionará un método general para identificar y probar genes reguladores clave para la autorrenovación y diferenciación de las células madre, así como para generar modelos de células madre de humanos. enfermedad. Por lo tanto, esta combinación de bioingeniería y biología celular tiene un gran potencial para crear una nueva e importante capacidad para la investigación básica y aplicada con células madre.
Declaración de beneficio para California:
Esta propuesta desarrollará nuevas herramientas y metodologías moleculares que mejorarán en gran medida el desarrollo científico, tecnológico y económico de la terapia con células madre en California. El beneficio neto más importante será para el tratamiento de enfermedades humanas. La introducción eficiente de modificaciones genéticas específicas en el genoma de una célula madre es una tecnología enormemente habilitante que impactaría en muchas aplicaciones médicas posteriores. Esta capacidad permitirá aún más investigaciones sobre la autorrenovación y la diferenciación, dos propiedades definitorias de las células madre humanas. Las nuevas herramientas para introducir alteraciones específicas de las células ES e iPS también producirán sistemas modelo clave para dilucidar los mecanismos de las enfermedades humanas y, lo que es más importante, permitirán la generación de líneas celulares mutantes que sirvan como modelos de enfermedades humanas y sistemas de detección de alto rendimiento para desarrollar nuevas tecnologías. terapias. Finalmente, el proceso inverso, la reparación de las lesiones genéticas responsables de la enfermedad, puede permitir a largo plazo la generación de líneas de células madre específicas de patentes para aplicaciones terapéuticas. Cada una de estas aplicaciones beneficiará directamente el conocimiento biomédico y la salud humana. Además, esta propuesta aborda directamente varios objetivos de investigación de esta RFA: el desarrollo y utilización de técnicas eficientes de recombinación homóloga para la selección de genes en células madre humanas, el desarrollo de vectores virales más seguros y eficaces para la transducción de genes en células madre humanas y el desarrollo y análisis de líneas de células madre embrionarias humanas con genes indicadores insertados en loci clave, lo que indica que CIRM cree que las capacidades propuestas son una prioridad para el esfuerzo de células madre de California. Si bien las aplicaciones potenciales de la tecnología propuesta son amplias, la aplicaremos a un problema biomédico específico y urgente: dilucidar los mecanismos de diferenciación de las células ES en neuronas dopaminérgicas, parte de un camino crítico hacia el desarrollo de terapias para la enfermedad de Parkinson. Si bien las hESC tienen claramente esta capacidad, los mecanismos subyacentes no se comprenden completamente y es necesario mejorar la eficiencia de este proceso. Aclararemos las redes transcripcionales que subyacen a este proceso y utilizaremos nuestro novedoso sistema de selección de genes para identificar y analizar componentes clave de estas redes. Este trabajo conducirá a una mejor comprensión fundamental de los mecanismos que regulan la diferenciación de las células madre, así como a mejorar nuestra capacidad para controlar este complejo proceso para aplicaciones biomédicas. Los coinvestigadores tienen un sólido historial en la traducción de la ciencia básica y la ingeniería a la práctica a través de interacciones con la industria, incluida la fundación de empresas de biotecnología en California. Finalmente, este proyecto colaborativo centrará a diversos grupos de investigación con muchos estudiantes en un importante proyecto interdisciplinario en la interfaz de la ciencia y la ingeniería, capacitando así a futuros empleados y contribuyendo al desarrollo tecnológico y económico de California.
Publicaciones
- Mol Ther (2011): Evolución dirigida de virus adenoasociados para mejorar la administración de genes y la focalización de genes en células madre pluripotentes humanas. (PubMed: 22108859)
- Métodos Mol Biol (2014): Selección genética mejorada de células madre adultas y pluripotentes utilizando virus adenoasociados evolucionados. (PubMed: 24557903)
- Mol Ther (2011): Una variante viral adenoasociada evolucionada mejora la entrega y la focalización de genes en las células madre neurales. (PubMed: 21224831)