Diferenciación de células madre embrionarias humanas en urotelio

El aumento o reemplazo de la vejiga suele ser necesario para el tratamiento de adultos con cáncer de vejiga y niños con lesión de la médula espinal o espina bífida. Las técnicas quirúrgicas actuales utilizan segmentos de intestino o estómago como sustituto de la pared de la vejiga. El uso de segmentos intestinales se asocia con muchas complicaciones, incluidas infecciones, cálculos, desequilibrio de sal y, lo más preocupante, cáncer. Un sustituto ideal de la pared de la vejiga sería el tejido vesical obtenido mediante bioingeniería. Las células madre parecen ser la solución ideal para la bioingeniería de tejidos. La capacidad de inducir células madre embrionarias humanas (hESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el urotelio, las células que recubren la vejiga, proporcionaría un avance importante en el campo de la ingeniería de tejidos, científica y clínicamente. Nuestros objetivos específicos son inducir la diferenciación de hESC en urotelio mediante señalización celular. También investigaremos los genes implicados en este proceso. Y probaremos la viabilidad de trasplantar urotelio derivado de hESC a una vejiga. En el último año hemos avanzado en el desarrollo de una técnica para la inducción de células madre embrionarias humanas en el urotelio. En el embrión en desarrollo, las células madre embrionarias están preprogramadas para convertirse en urotelio cuando son inducidas por señales apropiadas y oportunas. El desafío es simular esto en un plato de cultivo. Hemos descubierto que se puede inducir a las células madre embrionarias a formar urotelio cuando se exponen a factores de crecimiento liberados por urotelio adulto cultivado. Lo hemos hecho cultivándolos juntos (sin contacto) y actualmente estamos probando soluciones con estos factores de crecimiento. También estamos estudiando los mecanismos moleculares y genes implicados en este proceso. También hemos logrado avances significativos en nuestro tercer objetivo, que es probar la viabilidad del trasplante de urotelio cultivado. En un modelo animal pequeño hemos podido trasplantar de forma fiable estas células a la vejiga y demostrar su supervivencia e incorporación a la vejiga. Actualmente estamos probando mejores técnicas de trasplante y siguiendo a los animales durante más tiempo para determinar la vida útil de estas células. Esta investigación conducirá a avances en la biología de las células madre en un área importante que otros científicos no abordan. La finalización exitosa de este proyecto mejorará la salud humana, indirectamente a través de un mayor conocimiento de las vías de diferenciación relevantes para el desarrollo normal y la neoplasia, y directamente a través del desarrollo de metodologías novedosas para la bioingeniería de tejidos para adultos y niños con trastornos urológicos y cáncer. Estamos trabajando en un campo muy novedoso, que tiene un alto potencial para salvar vidas y mejorar enormemente la calidad de vida de muchos pacientes que necesitan extirpar o agrandar la vejiga.

El primer objetivo de este proyecto era inducir células madre embrionarias humanas (hESC) en el urotelio, que es el revestimiento epitelial del tracto urinario. Estas células son muy especializadas y únicas. Están recubiertas con un grupo de proteínas, llamadas uroplaquinas, que hacen que las células sean excepcionalmente impermeables a muchos contaminantes de la orina. Las uroplaquinas son producidas casi exclusivamente por células uroteliales, por lo que sirven como un marcador único para estas células y, por lo tanto, la alta expresión de uroplaquinas se considera sine qua non para identificar el urotelio. Así, podemos identificar células uroteliales en función de su expresión de proteínas uroplaquinas en la superficie celular, así como en el interior de las células, utilizando diversas técnicas experimentales. Evaluamos numerosas condiciones para inducir hESC en urotelio. El primer paso para hacer esto fue inducir las hESC en endodermo definitivo (DE), que es una etapa precursora de la diferenciación epitelial de las células que recubren los intestinos y el tracto urinario. Hicimos esto de manera muy eficiente y descubrimos que el medio de cultivo de células uroteliales especializado con aditivos de factor de crecimiento (uromedia) que hemos optimizado en nuestro laboratorio fue capaz de inducir alrededor del 20-30 % de las células DE en urotelio, según lo determinado por la expresión de uroplaquina. Dado que el urotelio constituye menos del 1% de las células del cuerpo, creemos que hemos desarrollado un sistema que induce hESC más allá de su preprogramación espontánea. También probamos la capacidad de cultivar DE con urotelio adulto o agregar factores de crecimiento producidos por urotelio adulto cultivado o músculo liso de la vejiga para aumentar la diferenciación, ninguno de los cuales logró aumentar la diferenciación de las células uroteliales de una manera estadísticamente significativa. Pudimos aislar el urotelio derivado de hESC utilizando una técnica que clasifica las células vivas según la expresión de proteínas (clasificación de células activadas por fluorescencia o FACS). Estas células, clasificadas según la expresión de uroplaquina en la superficie celular, se están cultivando y probando actualmente para determinar su expresión y función proteica. El segundo objetivo del proyecto era encontrar factores de transcripción (TF) que participen en la dirección de la diferenciación de hESC en urotelio. Los factores de transcripción afectan los mecanismos genéticos que conducen a la producción de proteínas. En nuestro caso, estábamos interesados ​​en qué TF estaban involucrados en la expresión temprana de uroplaquinas cuando DE se convirtió en urotelio. Como hay cientos de TF conocidos, nos centramos en aquellos que tienen sitios de unión potenciales cerca de los genes de uroplaquina. Utilizando diversas técnicas, descubrimos que ciertos TF se expresaban en las células al mismo tiempo que aparecían por primera vez las uroplaquinas. También pudimos ver que ciertos FT desaparecían a medida que las hESC se convertían en DE y luego en urotelio. Es necesario realizar más trabajos para determinar si estos TF realmente controlan la expresión de los genes de uroplaquina o si su coexpresión es coincidente. El tercer objetivo del proyecto era determinar si el urotelio podría trasplantarse a la vejiga de un roedor, sobrevivir y posiblemente incorporarse al órgano. Para la inyección, utilizamos células uroteliales cultivadas que fueron marcadas con un marcador genético fluorescente (proteína de fluorescencia verde – GFP) que permite distinguirlas de las células huésped incoloras. Las células uroteliales de GFP se obtuvieron de ratas transgénicas (todas las células de su cuerpo expresan GFP) o de urotelio infectado con un virus especializado que transfiere el gen GFP a las células. Se inyectó GFP-urotelio en las paredes de la vejiga de ratones y ratas. Lo ideal sería inyectar estas células debajo del revestimiento de estas vejigas. Este espacio potencial es microscópico y difícil de infiltrar incluso con vejigas fuera del cuerpo en la mesa del laboratorio. Por lo tanto, entrar en este espacio en un animal vivo bajo anestesia fue muy difícil. Principalmente, las células se inyectaron en la lámina propia, que es un espacio entre el músculo de la vejiga y el epitelio. Pudimos encontrar células trasplantadas viables a los pocos días de la inyección, pero no pudimos encontrar células en momentos tardíos después del trasplante. Esto podría deberse a que las células no vivían, o podría ser que muy pocas células sobrevivieron, pero no pudimos encontrarlas. Trabajo futuro: continuaremos evaluando el urotelio producido a partir de hESC en este proyecto. Esperamos poder demostrar que estas células aparecen y funcionan exactamente como el urotelio normal y así poder utilizarse para futuras aplicaciones de ingeniería de tejidos.