Hemos logrado avances significativos en el diseño, desarrollo y optimización de la instrumentación a nivel comercial de un sistema automatizado de cultivo de células de microfluidos y hemos demostrado una aplicación del sistema en la conversión directa de células de la piel humana (fibroblastos) en neuronas en el chip de microfluidos. Un desafío fundamental para la tecnología de células madre es encontrar las condiciones de cultivo celular adecuadas para hacer crecer las células y dirigirlas hacia el linaje deseado. El destino celular está determinado por la coordinación oportuna de muchos genes y factores ambientales. Sin embargo, con las herramientas disponibles actualmente, los experimentos multifactoriales suelen requerir mucha mano de obra y ser difíciles de llevar a cabo de manera reproducible. Utilizando la tecnología central de litografía suave multicapa en Fluidigm, hemos desarrollado un chip de microfluidos y un instrumento automatizado que puede cultivar células en el chip durante un período prolongado y entregar automáticamente múltiples combinaciones de diferentes factores a las células controladas por matrices de chips en el chip. Microválvulas de polímero. También se pueden recolectar células del chip para un cultivo continuo fuera del chip, un análisis genómico unicelular y/o ensayos funcionales. Hemos actualizado varios componentes clave del sistema (incluido hardware, firmware y software) y hemos mejorado significativamente el rendimiento y la confiabilidad del sistema. Hemos validado el rendimiento térmico, de presión y de fluidos del controlador del sistema y estamos planeando desarrollar y optimizar las otras partes de la instrumentación comercial en el próximo período. Para demostrar la aplicación biológica del sistema, hemos desarrollado un método novedoso para la dosificación a largo plazo de diferentes microARN y sus permutaciones/combinaciones en fibroblastos de piel humana en un chip y hemos logrado la conversión directa de los fibroblastos en neuronas. Recientemente, varios laboratorios han informado sobre la conversión directa de otro tipo de células en neuronas funcionales de ratón y humanas y subtipos neuronales específicos sin que las células se reprogramen primero a una etapa de células madre. En comparación con la diferenciación de las células madre, la conversión directa es mucho más rápida y eficiente y puede reducir las aberraciones genéticas/epigenéticas asociadas con la inducción de células madre. Nuestro nuevo enfoque de dosificación segura no viral generó neuronas con alta eficiencia y viabilidad celular. Los resultados coincidieron con los informes publicados y se confirmaron en un formato de cultivo de plato grande. El sistema de cultivo celular de microfluidos permite un control preciso del microambiente de las células y es ventajoso en la detección de condiciones multifactoriales para el mantenimiento, diferenciación y reprogramación celular con un consumo mínimo de reactivos. Creemos que este sistema será una herramienta valiosa para la comunidad de investigación de células madre tanto en la comprensión de los mecanismos básicos de señalización biológica como en el desarrollo de terapias basadas en células.
Período de información:
Los estudiantes de Year 2
Hemos desarrollado y optimizado aún más la instrumentación a nivel comercial de un sistema automatizado de cultivo de células de microfluidos y hemos implementado un sistema prototipo en un sitio colaborador para realizar pruebas. Hemos demostrado que podemos transformar células en diferentes tipos de neuronas utilizando sólo factores químicamente definidos, es decir, sólo reactivos que podrían usarse en un protocolo clínico. Hemos demostrado que podemos hacer esto de varias maneras diferentes (ya sea con ácidos nucleicos sintéticos (ARN) o moléculas pequeñas como los medicamentos). Además, hemos demostrado que podemos sacar células del sistema y medir la expresión genética de células individuales individualmente.
Encontrar las condiciones de cultivo adecuadas para cultivar células y transformarlas en los tipos de células deseados es fundamental para la investigación con células madre y las terapias basadas en células. También es un gran desafío: los experimentos en sistemas de cultivo tradicionales suelen requerir mucha mano de obra y son difíciles de reproducir debido a la necesidad de detectar muchos factores involucrados en los procesos celulares. Utilizando tecnologías de microfluidos avanzadas en Fluidigm, hemos desarrollado un prototipo de instrumento automatizado que puede cultivar células en chips de microfluidos durante más de 2 semanas y dosificar automáticamente diferentes células con diferentes permutaciones y combinaciones de múltiples factores. En el último año, hemos optimizado aún más los componentes clave del sistema para mejorar el rendimiento de entrega térmica, de presión y de fluidos. También hemos rediseñado el sistema de control ambiental para que pueda ser un módulo complementario a un instrumento comercial (el sistema de preparación automática de una sola célula C1), lo que facilitará a los investigadores realizar este tipo de experimentos de detección de condiciones de cultivos celulares. Se han diseñado y probado dos nuevas versiones de chips de microfluidos para ofrecer una mayor flexibilidad en el esquema de dosificación celular y una mayor duración de los experimentos desatendidos. Las células se pueden teñir con marcadores específicos de tipo celular marcados con fluorescencia en un chip y las imágenes escaneadas con un microscopio automatizado. También hemos optimizado un flujo de trabajo para exportar células vivas desde el chip de cultivo y analizar los perfiles de expresión genética de células individuales que pueden arrojar luz sobre la variabilidad entre células dentro de una población celular.
Un tipo de célula diana deseado puede derivarse in vitro mediante conversión directa de otro tipo de célula comprometida o diferenciación de células madre o células progenitoras. La conversión directa suele ser mucho más rápida y eficiente, pero las células madre, especialmente las pluripotentes inducidas, son más versátiles y proliferativas y más fáciles de generar millones de células. Hemos demostrado ambos métodos en un chip convirtiendo fibroblastos humanos en neuronas con combinaciones de microARN y ARN mensajeros, y diferenciando células madre pluripotentes inducidas por humanos en neuronas receptoras del dolor con moléculas pequeñas. Los resultados coincidieron con los informes publicados y se confirmaron en un formato de cultivo de plato grande. Hemos establecido condiciones químicamente definidas para ambos protocolos y actualmente estamos optimizando los protocolos para una mayor eficiencia de inducción y una mejor salud celular.
Debido a su control preciso y fácil configuración de experimentos de detección multifactorial, creemos que este sistema automatizado será una herramienta valiosa para la comunidad de investigación en células madre y biología celular en general, y planeamos continuar nuestros esfuerzos para optimizar la instrumentación y explorar las aplicaciones biológicas.
Período de información:
Los estudiantes de Year 3
Utilizando tecnologías de microfluidos avanzadas en Fluidigm, hemos desarrollado un sistema de cultivo celular automatizado a nivel comercial. Hemos logrado avances significativos en el desarrollo de sistemas y aplicaciones de biología durante el transcurso de la subvención CIRM. Hemos estado trabajando para que la tecnología esté disponible para la comunidad de células madre en general y para optimizar la instrumentación, los chips y los protocolos biológicos.
Los cultivos celulares son plataformas invaluables para comprender los mecanismos biológicos básicos y para aplicaciones biomédicas como diagnóstico, detección de fármacos y terapias biológicas y celulares. Sin embargo, encontrar las condiciones de cultivo adecuadas para hacer crecer las células y dirigirlas hacia los tipos deseados suele ser un gran desafío: debido a que cada proceso celular requiere múltiples factores, los experimentos en los sistemas de cultivo tradicionales requieren mucha mano de obra y, a menudo, son difíciles de reproducir. Para afrontar este desafío, hemos desarrollado un prototipo de sistema automatizado que permite cultivar células en chips de microfluidos durante más de 3 semanas y dosificar automáticamente las células con múltiples condiciones combinatorias. Se pueden llevar a cabo en paralelo 32 condiciones diferentes usando diferentes permutaciones, combinaciones y proporciones de 16 reactivos diferentes; Las condiciones del tratamiento celular también se pueden programar para que cambien en diferentes momentos. Hemos demostrado la dosificación de células con miARN, ARNm, ADN, proteínas, virus, moléculas pequeñas, etc., y hemos desarrollado protocolos optimizados para teñir y obtener imágenes de células en un chip o separar las células en un chip y exportar contenido genético para su análisis posterior. También demostramos la recolección de células vivas de cada microcámara para analizar la expresión genética de células individuales individualmente.
Durante el año pasado, rediseñamos y fabricamos una nueva versión del módulo de control ambiental (EC) que tiene un rendimiento mucho mejor y está muy cerca de la producción comercial. El nuevo EC funciona junto con un sistema de preparación automática de celda única C1 comercial Fluidigm modificado para proporcionar un control estable y preciso de la temperatura, la humedad y la presión para el cultivo celular a largo plazo y la dosificación combinada. También desarrollamos y probamos varias versiones nuevas de chips de cultivo celular con mejoras incrementales; y comenzó a desarrollar un software basado en una interfaz gráfica de usuario intuitiva para que los usuarios planifiquen experimentos, controlen protocolos de tiempo de ejecución y analicen datos.
Para aplicaciones en biología, previamente demostramos dos formas de transformar células en diferentes tipos de neuronas usando solo factores definidos químicamente: convirtiendo células de la piel humana en neuronas usando combinaciones de microARN y ARN mensajeros, y diferenciando células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). ) en neuronas receptoras del dolor con moléculas pequeñas. Durante el año pasado, desarrollamos un método definido químicamente para inducir hiPSC a células progenitoras neuronales (NPC), células que dan lugar a neuronas y otros tipos de células neuronales.
También hemos dedicado importantes esfuerzos a desarrollar un método químicamente definido para probar la pluripotencia de las iPSC humanas en un chip. Las hiPSC se generan directamente a partir de células adultas; pueden propagarse indefinidamente y dar origen a todo tipo de células del cuerpo. Debido al tremendo potencial terapéutico de las hiPSC, cada año se generan miles de nuevas líneas de hiPSC; sin embargo, no todas las hiPSC son iguales: debido a las variaciones en las células originales y los métodos de reprogramación utilizados, existe una enorme variabilidad en las líneas celulares en términos de qué tan bien se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. La prueba estándar para el potencial de diferenciación requiere mucho tiempo, es costosa y requiere pruebas con animales. Creemos que una prueba de pluripotencia funcional in vitro estandarizada (que prueba los potenciales de diferenciación directa de las iPSC/ESC humanas en las tres capas germinales en un chip) será más útil para la comunidad de células madre. Hemos logrado avances significativos en el desarrollo de métodos y generamos resultados de prueba de concepto que muestran que nuestras condiciones personalizadas utilizando medios definidos químicamente y factores de señalización pueden dirigir las hiPSC a las tres capas germinales. Actualmente estamos optimizando los protocolos y desarrollando herramientas automatizadas de análisis de datos y planeamos continuar este trabajo más allá del período de subvención CIRM.
A partir de estos trabajos, Fluidigm ha decidido comercializar el sistema automatizado de cultivo celular de microfluidos. Debido a su control preciso y la automatización de experimentos de detección multifactorial, creemos que el sistema será una herramienta valiosa para la comunidad de células madre y la biología celular en general.
Detalles de la solicitud de subvención
Titulo de la aplicación:
Desarrollo y aplicación de un sistema de cultivo celular de microfluidos versátil y automatizado
Resumen público:
Con el respaldo parcial de una subvención anterior de herramientas y tecnologías del CIRM [ELIMINADO], hemos optimizado y ampliado chips de cultivo celular (microfluídicos) altamente avanzados hasta lograr una forma fabricable, hemos producido prototipos de instrumentos para controlar estos chips y hemos demostrado que podemos cultivar células, dosificar con combinaciones de reactivos y exportarlos nuevamente fuera del chip.
Dado que el estado de una célula está controlado por múltiples genes, los experimentos para controlar el estado de la célula (por ejemplo, convertir células de la piel en células madre o convertir células madre en células nerviosas) casi siempre implicarán también múltiples factores. Creemos que la capacidad de realizar experimentos multifactoriales de forma más rápida, sencilla y reproducible permitirá el campo de las células madre.
La investigación que proponemos aquí impulsará aún más las capacidades de este sistema al producir un conjunto de tres instrumentos comerciales complementarios: un Controlador (capaz de control total de fluidos y ambiental en un chip), un Hotel (capaz de control de fluidos y ambiental limitado en múltiples chips) y un lector (capaz de obtener imágenes de las células en el chip en modos de contraste de fase y fluorescencia). La idea es cargar las células y dosificarlas con diferentes fármacos/químicos en el Controlador, transferirlas al Hotel para cultivo y mantenimiento, y transferirlas al Lector para obtener imágenes periódicas, permitiendo así ejecutar múltiples series de experimentos en paralelo y aumentar aún más. más el rendimiento del sistema.
También proponemos dos conjuntos de experimentos para demostrar lo que el sistema puede hacer: en el primero, desarrollaremos nuevos métodos para convertir células IPS (células madre obtenidas mediante la reprogramación de células no madre, como células de la piel, por ejemplo) en células progenitoras neurales. – células que pueden convertirse en diferentes tipos de células neuronales. Estas células podrían utilizarse para estudiar enfermedades como el Parkinson o el Alzheimer. En la segunda serie de experimentos, desarrollaremos métodos para hacer que estas células proliferen sin convertirse en tipos específicos de células neuronales. Dado que estos tipos de células son potencialmente útiles para tratar enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, Parkinson y Alzheimer) y lesiones de la médula espinal, el desarrollo de métodos para producir más de ellas podría acercar este campo un paso más a la aplicación clínica. En ambos casos evitaremos el uso de sueros y productos animales, ya que los métodos que utilizan estos productos no pueden utilizarse clínicamente.
Declaración de beneficio para California:
La investigación propuesta aquí permitirá llevar a la amplia comunidad de células madre, dentro y fuera de California, un sistema comercial que acelerará la investigación dirigida a 1.) Identificar genes y moléculas pequeñas que afectan la autorrenovación y diferenciación de las células madre. 2.) Identificar las células madre. condiciones de diferenciación y expansión de células Dado que la subvención apoyará el trabajo realizado en [ELIMINADO] y [ELIMINADO], y el resultado final será la creación de un conjunto de instrumentos comerciales, existe un efecto multiplicador económico directo para los recursos invertidos. En particular, se crearán al menos tres puestos (2 puestos de ingeniero y un puesto postdoctoral) tan pronto como comience el proyecto. La disponibilidad del sistema acelerará el descubrimiento de las condiciones de diferenciación y expansión celular, multiplicando el poder de la investigación con células madre, en la que California es líder. La identificación más eficiente de las condiciones de diferenciación y expansión debería permitir nuevas terapias. Más directamente, el descubrimiento de condiciones para la diferenciación de células IPS en células progenitoras neurales debería permitir el uso de esas células como modelos de enfermedades (por ejemplo, para el Alzheimer o el Parkinson); El descubrimiento de condiciones químicamente definidas para la expansión de esas células progenitoras neurales podría conducir a terapias celulares para enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson o las lesiones de la médula espinal. La disponibilidad de herramientas poderosas en California, como las que desarrollaremos aquí, ayudará a garantizar que estas nuevas terapias sean pioneras en California, lo que conducirá a la creación de empleos y a la disponibilidad de la atención médica más avanzada del mundo para los ciudadanos de California.
