Derivación y caracterización de células madre de trastornos mieloproliferativos a partir de células ES humanas

Resumen del progreso general Esta subvención se centra en la generación de células madre MPN a partir de hESC o CB y correlaciona el potencial leucémico con muestras de pacientes MPN. En el primer año de esta subvención, hemos demostrado que 1) las hESC se diferencian en el estroma AGM a la etapa CD34+, lo que se asocia con una mayor expresión de GATA-1, Flk2, GATA-2 y ADAR1; 2) la diferenciación de hESC CD34+ aumenta in vitro e in vivo en presencia de un estroma de ratón modificado genéticamente, que produce factor de células madre humanas, IL-3 y G-CSF; 3) Las células hESC CD34+ se pueden transducir con nuestro nuevo vector lentiviral BCR-ABL, que, a diferencia del BCR-ABL retroviral, puede transducir células madre inactivas; 4) La expresión de BCR-ABL por parte de los progenitores de CP CML no sostiene el injerto, sino que la transformación leucémica se basa, en parte, en la sobreexpresión de bcl-2; 5) La expresión de JAK2V617F en células madre hES o CB es insuficiente para inducir la transformación leucémica; 6) Las células hESC CD34+ transducidas con BCR-ABL tienen un potencial de trasplante de BCR-ABL significativamente mayor que los progenitores de CP CML, lo que sugiere que tienen una mayor capacidad de supervivencia; 7) la transducción lentiviral de -catenina de células BCR-ABL hESC CD34+ conduce a un trasplante en serie indicativo de la formación de LSC; 8) CML BC LSC persiste in vivo a pesar de la potente inhibición de BCR-ABL con la terapia con dasatinib y probablemente requerirá una terapia inhibidora combinada para erradicarla. Actualmente, se están llevando a cabo matrices HEEBO y estudios de flujo de fosfo para detectar miembros de la familia bcl-2 y la expresión de proteínas de autorrenovación en células hESC y CB CD2+ transducidas con BCR-ABL y JAK617 V34F en comparación con progenitores derivados de pacientes con MPN. Esto ayudará en el desarrollo de estrategias combinadas de inhibidores de células madre MPN en esta subvención.

Esta subvención se centra en la generación de células madre de trastorno mieloproliferativo o neoplasia (MPN) a partir de células madre pluripotentes (hESC) o multipotentes (CB) y busca correlacionar su potencial leucémico con el de las células madre derivadas de muestras de pacientes con MPN. Para proporcionar una plataforma para probar la inducción de la diferenciación, la supervivencia y la autorrenovación de las células madre mediante BCR-ABL frente a JAK2, se utilizaron hESC durante el primer año y, a medida que estuvieron disponibles más muestras de pacientes y sangre del cordón umbilical, se utilizaron. En el primer año de esta subvención, descubrimos que las hESC experimentan una diferenciación hematopoyética en el estroma AGM hasta la etapa CD34+, lo que da como resultado una mayor expresión de GATA-1, Flk2, ADAR1 y GATA-2. Además, la diferenciación de CD34+ se mejoró en un estroma de ratón modificado genéticamente (SL/M2) que secreta SCF, IL-3 y G-CSF humanos. Las células CD34+ derivadas de hESC transducidas con BCR-ABL lentivirales tenían un mayor potencial de trasplante celular BCR-ABL+ que los progenitores de LMC en fase crónica (CP), lo que indica una mayor capacidad de supervivencia. Sin embargo, mantuvieron la autorrenovación sólo cuando se cotransdujeron con lentiviral -catenina (Rusert et al, manuscrito en preparación), lo que sugiere que la evolución de la crisis blástica requiere la adquisición de un mayor potencial de supervivencia y autorrenovación. De manera similar, la expresión de JAK2 mutante lentiviral de ratón en células madre hESC o CB fue insuficiente para producir células madre MPN autorrenovables, lo que indica que el contexto celular, la naturaleza del conductor genético y las respuestas a señales extrínsecas del microambiente desempeñan papeles fundamentales en la regulación terapéuticamente resistente. Propiedades de las células madre MPN, como supervivencia aberrante, diferenciación, autorrenovación y latencia. En el segundo año de esta subvención de cinco años, nos hemos centrado en células madre de sangre del cordón umbilical (CB) humano en comparación con una gran cantidad de muestras de pacientes MPN propagadas en estroma SL/M2 o en ratones RAG2-/-c-/- para recapitular más adecuadamente el nicho de células madre del MPN humano. Además, para recapitular más fielmente las MPN impulsadas por JAK2 humanas (en lugar de los vectores lentivirales JAK2008 de ratón publicados anteriormente, Cancer Cell 2), clonamos JAK2 humana de tipo salvaje y JAK2 V617F humana a partir de muestras de pacientes con MPN en vectores lentivirales-GFP (Court Recart A *, Geron I* et al, manuscrito en preparación). También incorporamos secuenciación de ARN transcriptoma completo (ABI SOLiD 4.0), matriz de PCR y tecnología de fosfoproteómica nanofluídica para evaluar mejor el impacto de JAK2 frente a BCR-ABL en el destino, la supervivencia, la autorrenovación y la latencia de las células madre en el contexto de microambientes malignos específicos y la susceptibilidad relativa de las células madre MPN en estos nichos a inhibidores de agente único molecularmente dirigidos.

Esta subvención se centra en la generación de células madre de trastorno mieloproliferativo o neoplasia (MPN) a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes (hESC) o células madre multipotentes de sangre del cordón umbilical (CB), y busca correlacionar su potencial leucémico con el de la progresión de la enfermedad en una muestra de pacientes con MPN. -células madre derivadas. En el primer y segundo año de esta subvención, encontramos que las células CD34+ derivadas de hESC transducidas con BCR-ABL lentivirales tenían un mayor potencial de trasplante leucémico que los progenitores de leucemia mieloide crónica (LMC) en fase crónica (CP). Sin embargo, mantuvieron la autorrenovación solo cuando se cotransdujeron con beta-catenina lentiviral, lo que sugiere que la evolución de la crisis blástica (BC) requiere la adquisición de un mayor potencial de supervivencia y autorrenovación. De manera similar, hemos demostrado, utilizando vectores lentivirales, que el mutante JAK2 de ratón y humano era insuficiente para producir células madre MPN autorrenovables. Los nuevos resultados del año 3 demuestran que la activación de BCR-ABL y JAK2 impulsa la diferenciación de progenitores hematopoyéticos hacia un sesgo de linaje ertiroideo/mieloide. Hemos utilizado la tecnología de secuenciación de ARN transcriptómica completa (RNA-Seq) para evaluar el estado genético y epigenético de células progenitoras normales transducidas con BCR-ABL y JAK2, así como progenitores MPN derivados de pacientes. Esto nos ha permitido investigar los mecanismos de diferenciación aberrante y autorrenovación de los progenitores MPN e identificar firmas de expresión genética únicas de la progresión de la enfermedad. Anteriormente descubrimos que la sobreexpresión y el cambio de isoformas de empalme de una enzima clave de edición de ARN, la adenosina desaminasa que actúa sobre el ARNds (ADAR), y los cambios de isoformas de empalme en miembros de la familia BCL2 que favorecen la supervivencia, se corresponden con la progresión de la enfermedad en la leucemia mieloide crónica. En el período del informe actual, los análisis de RNA-Seq revelaron que la activación de la edición de ARN impulsada por ADAR1 contribuyó a la reprogramación de progenitores malignos, promoviendo la diferenciación aberrante y la autorrenovación de las células madre MPN. Derribar ADAR1 utilizando vectores lentivirales de shRNA redujo el potencial de autorrenovación de los progenitores de CML. Este trabajo culminó en un manuscrito que ahora se envió a PNAS (Jiang et al.). Resultados recientes también muestran que ADAR1 se activa en progenitores de pacientes con MPN impulsadas por JAK2. Por lo tanto, ADAR1 puede ser un factor importante que funciona en conjunto con BCR-ABL o JAK2 para facilitar la progresión de la enfermedad en las MPN. Nuestros resultados muestran que otro factor de autorrenovación que puede impulsar la propagación de enfermedades mediada por BCR-ABL o JAK2 a partir de progenitores MPN inactivos es Sonic hedgehog (Shh). Hemos examinado los patrones de expresión de esta vía en progenitores de MPN utilizando qRT-PCR y RNA-Seq, y hemos probado un inhibidor farmacológico de esta vía en un modelo robusto de cocultivo estromal de progresión de MPN a leucemia mieloide aguda (AML). En resumen, hemos utilizado el transcriptoma completo RNA-Seq y qRT-PCR junto con ensayos de progenitores hematopoyéticos y estudios in vivo para evaluar el impacto de JAK2 versus BCR-ABL en el destino, la supervivencia, la autorrenovación y la latencia de las células madre. Estas técnicas nos han permitido investigar con más detalle el papel de las alteraciones genéticas y epigenéticas que impulsan la progresión de la enfermedad en el contexto de microambientes malignos específicos, y la susceptibilidad relativa de las células madre de MPN en estos nichos a inhibidores moleculares de un solo agente.

Los principales objetivos de este proyecto son la generación de células madre de trastorno mieloproliferativo o neoplasia (MPN) a partir de células madre embrionarias humanas pluripotentes (hESC) o células madre multipotentes, y la identificación de factores cruciales de supervivencia y autorrenovación de las células madre de leucemia (LSC) que contribuyen. al desarrollo y progresión de trastornos hematopoyéticos impulsados ​​por BCR-ABL y JAK2. Un hallazgo clave de nuestro trabajo hasta el momento es que, además de la activación de los oncogenes BCR-ABL o JAK2, la generación de MPN LSC autorrenovables requiere la estimulación de otros factores de supervivencia y autorrenovación como la β-catenina, Sonic hedgehog ( SHH), BCL2 y, en particular, la enzima de edición de ARN ADAR1, que identificamos como un nuevo regulador de la diferenciación y autorrenovación de LSC. Ahora hemos completado análisis integrales de expresión génica a partir de estudios de secuenciación de ARN de próxima generación realizados en células progenitoras hematopoyéticas humanas normales y leucémicas a partir de muestras de sangre de cordón umbilical primaria y muestras de sangre periférica normal de adultos, junto con sangre de cordón umbilical normal transducida con oncogenes BCR-ABL o JAK2. y muestras primarias de pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) en fase crónica BCR-ABL+ y crisis blástica. Estos estudios revelaron que los patrones de expresión genética en las vías de supervivencia y autorrenovación (SHH, JAK2, ADAR1) distinguen claramente las células progenitoras normales y leucémicas, así como las etapas de la enfermedad MPN. Estos datos proporcionan un amplio recurso para la identificación de biomarcadores específicos de LSC con aplicaciones clínicas de diagnóstico y pronóstico, además de proporcionar nuevos objetivos terapéuticos potenciales para prevenir la progresión de la enfermedad. Nuevos resultados de estudios de secuenciación de ARN revelan altos niveles de expresión de mediadores inflamatorios en progenitores de leucemia mieloide crónica en crisis blástica humana y en células madre de sangre de cordón umbilical normal transducidas con BCR-ABL. Además, la expresión de la forma de ADAR1 que responde a la inflamación se correlaciona con la generación de un producto del gen GSK3β empalmado anormalmente que se ha relacionado previamente con la autorrenovación de LSC. Estos resultados se han publicado ahora en la revista PNAS (Jiang et al.). Juntos, hemos demostrado que ADAR1 impulsa el destino de las células hematopoyéticas al sesgar la diferenciación celular (una tendencia que ocurre durante el envejecimiento normal de la médula ósea) y promueve la autorrenovación de las LSC mediante el empalme alternativo de factores críticos de supervivencia y autorrenovación. En particular, la inhibición de ADAR1 mediante estrategias de eliminación genética redujo la capacidad de autorrenovación de CML LSC y puede tener aplicaciones importantes en el tratamiento de otros trastornos que se transforman en leucemia aguda. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la edición y el empalme de ARN (ADAR1) representan objetivos terapéuticos clave para prevenir la autorrenovación de LSC, un factor principal de la progresión leucémica. Los estudios de perfiles de transcriptoma completos junto con qRT-PCR, ensayos de progenitores hematopoyéticos y estudios in vivo han demostrado que la inhibición combinada de BCR-ABL y JAK2 es otro método eficaz para reducir la autorrenovación de LSC en modelos preclínicos. Nuevos resultados muestran que la expresión de BCR-ABL o JAK2 impuesta por lentivirus en células madre de sangre de cordón umbilical normal impulsa la generación de distintas isoformas de empalme de STAT5a. Si bien la inhibición de la señalización de JAK2/STAT5a o la actividad de la tirosina quinasa BCR-ABL por sí sola no erradicó el LSC autorrenovador, la inhibición combinada de JAK2 y BCR-ABL afectó dramáticamente la supervivencia y la autorrenovación del LSC en el nicho protector de la médula ósea, y aumentó la vida útil de receptores de trasplantes en serie. Estos efectos se asociaron con la reducción de la expresión de la isoforma STAT5a, que representa un nuevo marcador molecular de respuesta a la inhibición combinada de BCR-ABL/JAK2, y la expresión alterada de genes del ciclo celular en células progenitoras humanas extraídas de la médula ósea de ratones trasplantados. Estos resultados son el tema de un nuevo manuscrito actualmente en revisión (Court et al.). Además, este trabajo ha llevado al desarrollo de nuevas herramientas experimentales que facilitarán el estudio del mantenimiento de las LSC y el estado del ciclo celular en el contexto de microambientes de médula ósea normales versus enfermos. En resumen, los estudios completados hasta ahora han descubierto un papel para las alteraciones de edición y empalme de ARN en la progresión leucémica, particularmente en microambientes específicos. Utilizando inhibidores específicos dirigidos a BCR-ABL y JAK2, junto con estrategias para bloquear la edición de ARN y las actividades de empalme aberrante, hemos podido establecer la susceptibilidad relativa de las células madre MPN a los inhibidores moleculares con actividad contra LSC que residen en nichos hematopoyéticos selectos que son difíciles de tratar con agentes quimioterapéuticos convencionales.

En el último año de este proyecto, nos centramos en dilucidar los mecanismos de generación de células madre de leucemia (LSC) en JAK2 en comparación con las neoplasias mieloproliferativas (NMP) iniciadas por BCR-ABL1, anteriormente llamadas trastornos mieloproliferativos. Con este fin, investigamos los efectos de propagación de células madre MPN de BCR-ABL1 o JAK2 solos o en combinación con la activación de la ARN editasa de células madre embrionarias humanas, ADAR1. Recientemente, descubrimos que ADAR1, que edita bases de adenosina a inosina en el contexto de secuencias Alu específicas de primates, conduce al empalme incorrecto de GSK3β y a la activación de β-catenina en progenitores de LMC en fase crónica (CP), lo que conduce a la transformación de la crisis blástica (BC) y la generación de LSC. . Además, la expresión variante de isoforma de un gen diana Wnt/β-catenina, CD44, también era característica de LSC. En un informe anterior (Jiang et al., PNAS 2013), la identificación de ADAR1 como un factor de reprogramación maligno representó la primera descripción de la edición de ARN como regulador de la reprogramación. Cuando se sobreexpresa lentiviralmente, ADAR1 dota a los progenitores mieloides CP comprometidos de capacidad de autorrenovación. Estudios adicionales revelaron que JAK2/STAT5a activa ADAR1, lo que conduce a la desregulación de la progresión del ciclo celular y a la regulación negativa global de la expresión de microARN, descubriendo así dos mecanismos clave adicionales de generación de LSC en las MPN. Esto es consistente con nuestros hallazgos de los estudios de perfiles de expresión genética realizados el año anterior, junto con la clasificación funcional y el análisis de redes utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA), que muestra que los genes relacionados con el ciclo celular se alteraron significativamente en progenitores humanos de ratones xenoinjertados tratados con terapia combinada con inhibidores de JAK2 y BCR-ABL en comparación con terapias con un solo agente. En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición combinada de BCR-ABL y JAK2 perjudica la supervivencia y la autorrenovación de las LSC mediante la modulación del ciclo celular. ADAR1 y otras vías reguladoras de células madre, como CD44, representan nuevos objetivos para detectar y erradicar el LSC autorrenovador. También realizamos nuevos estudios que dilucidan los cambios genéticos intrínsecos de las células madre que ocurren durante el envejecimiento de la médula ósea humana, que pueden contribuir a las alteraciones funcionales dependientes de BCR-ABL o JAK2. Este trabajo ha llevado al descubrimiento de un papel novedoso para los genes de células madre embrionarias y las isoformas de empalme, incluido ADAR1 p150 y una variante de transcripción de CD44, en el mantenimiento de LSC que promueven la progresión de MPN. Además, a lo largo de esta investigación hemos 1) desarrollado nuevas herramientas lentivirales para investigar la supervivencia, diferenciación, autorrenovación y regulación del ciclo celular del tallo y progenitor hematopoyético normal (HSPC) y del LSC maligno, y 2) ideado un diagnóstico innovador del LSC. estrategias y 3) estrategias terapéuticas probadas dirigidas a la edición de ARN asociado a LSC y la generación de isoformas de empalme que inhiben selectivamente la autorrenovación de LSC.