La distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD) es la tercera distrofia muscular hereditaria más común. No existe cura ni tratamiento para esta enfermedad ya que no se comprende el mecanismo de la enfermedad. Encontramos evidencia de que la FSHD es una enfermedad de "anomalía de la cromatina", en la que la metilación de histonas específicas y la unión de factores que afectan el silenciamiento de genes se pierden en regiones genómicas específicas. Nuestra hipótesis es que la estructura de la cromatina importante para la regulación genética está comprometida en la FSHD. Dado que descubrimos que esta estructura de cromatina se establece en células madre embrionarias humanas (hES) normales, es fundamental examinar cómo este proceso falla en la FSHD durante la diferenciación de células hES en células del músculo esquelético. Por lo tanto, nuestro principal objetivo es establecer líneas celulares hES a partir de embriones normales y afectados y optimizar un protocolo para diferenciar las células hES en células del músculo esquelético para análisis comparativos. Esto no es sólo para nuestra investigación, sino también para su uso en la comunidad de investigación de FSHD, lo que debería ayudar a comprender la etiología y patogénesis de la FSHD, así como posiblemente desarrollar estrategias terapéuticas. Durante el último año, continuamos optimizando la diferenciación de mioblastos esqueléticos de las células hES mediante el uso de varios protocolos diferentes. Si bien pudimos detectar la expresión de genes marcadores específicos del linaje muscular (es decir, Pax7 y MyoD) durante la diferenciación de las células ES, el nivel de expresión se mantuvo bajo y continuamos investigando diferentes protocolos para una mejor inducción genética y enriquecimiento de la población celular adecuada mediante clasificación de células. Es esencial alcanzar una densidad suficientemente alta de mioblastos derivados para permitirles formar miotubos, que es el elemento básico fundamental del músculo esquelético. La muy reciente publicación (es decir, junio de 2009) de un protocolo detallado para la derivación de células del músculo esquelético a partir de células hES debería ser de gran ayuda para nosotros, ya que destaca varios factores clave que probablemente sean cruciales para el éxito. Además, hemos adquirido con la aprobación hSCRO adecuada el primer lote de siete embriones donados por un paciente donante con FSHD. De siete embriones, inicialmente descongelamos cinco y seguimos su crecimiento en placas de cultivo. Sin embargo, estos embriones fueron congelados hace cinco años en condiciones subóptimas y no lograron desarrollarse más en cultivo para que podamos derivar células madre embrionarias. Estamos en el proceso de descongelar los dos embriones restantes, aunque pueden persistir problemas similares. Actualmente, hemos identificado dos fuentes adicionales de embriones FSHD. El proceso de adquisición se ha prolongado considerablemente debido a cambios recientes en las regulaciones de los NIH que requirieron la modificación del formulario y el proceso de consentimiento. Sin embargo, con la ayuda de nuestro colaborador de Scripps, el Dr. Jeanne Loring, estamos en el proceso de obtener cinco embriones adicionales y hemos solicitado una extensión “sin costo” de este proyecto para completar la derivación de células hES a partir de estos embriones. Durante el año pasado, publicamos nuestra caracterización inicial de la estructura de la cromatina en células de pacientes con FSHD en comparación con células normales de diferentes tipos de células, incluidas las células hES. Detectamos diferencias en cómo una de las proteínas histonas se modifica químicamente en ciertas regiones de los genomas en células normales versus FSHD. Esto es importante ya que las proteínas histonas no sólo ayudan a empaquetar el ADN para formar el elemento básico de la cromatina, sino que también desempeñan un papel enorme en el control de la expresión genética. Dado que los efectos de la FSHD probablemente sean el resultado de una regulación anormal de la expresión de ciertos genes, nuestro trabajo identificó un "marcador" de cromatina relevante que es potencialmente útil con fines de diagnóstico. Además, nuestros hallazgos definen una forma de seguir cualquier cambio en la regulación del gen objetivo durante el proceso de diferenciación (es decir, de células hES a mioblastos y miotubos) en células hES normales y FSHD. El manuscrito publicado fue seleccionado para “Facultad de 1000” y ya nos pidieron que escribiéramos una reseña sobre este tema. Además, hemos obtenido financiación NIH R01 para realizar más análisis de alto rendimiento de la estructura de la cromatina en FSHD. En conjunto, con el apoyo de la subvención CIRM SEED, estamos avanzando para comprender la anomalía de la cromatina durante la diferenciación celular vinculada a la patogénesis de la FSHD.

Detalles de la solicitud de subvención

Titulo de la aplicación:

Derivación y caracterización de células ES humanas a partir de embriones FSHD.

Resumen público:

La distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHD) es la tercera distrofia muscular hereditaria más común. Es autosómica dominante, lo que significa que si uno de los padres tiene la enfermedad, sus hijos tienen una probabilidad de 50:50 de padecerla también. La FSHD se caracteriza por debilidad progresiva y atrofia de la musculatura de la cara, los hombros y la parte superior del brazo, que puede extenderse a otras partes del cuerpo. En algunos casos se acompaña de pérdida de audición y, en casos graves, de retraso mental. No existe cura ni tratamiento para esta enfermedad ya que no se han identificado los genes responsables de esta enfermedad. Una cosa que está clara es que la mayoría de la FSHD está relacionada con una disminución en el número de repeticiones de una secuencia de ADN llamada D4Z4 ubicada al final del cromosoma 4. Cuando se produce un acortamiento de esta región repetida en cualquiera de los cromosomas 4, la persona obtiene FHD. Sin embargo, no está claro cómo el acortamiento de esta repetición conduce a la enfermedad. Descubrimos que este grupo de repeticiones D4Z4 contiene una estructura de "heterocromatina", que está asociada con el silenciamiento de genes. Esta estructura de heterocromatina incluye la metilación específica de la histona H3 y el reclutamiento de proteínas de unión a heterocromatina HP1 y cohesina. Se sabe que HP1 es necesario para el silenciamiento de genes. Es importante destacar que encontramos que esta estructura de heterocromatina se pierde únicamente en las células de pacientes con FSHD. Sorprendentemente, la población menor de pacientes con FSHD que no presentan ningún acortamiento repetido también carece de esta estructura de heterocromatina en la repetición D4Z4 en el cromosoma 4. Por lo tanto, la FSHD es una enfermedad de “anomalía de la heterocromatina”, en la que la pérdida de heterocromatina en las repeticiones D4Z4 conduce a la enfermedad. manifestación. Nuestra hipótesis es que la estructura normal de la heterocromatina propaga los efectos silenciadores a otros genes, pero en la FSHD este efecto se pierde y estos genes que normalmente son silenciosos pueden expresarse de manera anormal. Dado que descubrimos que esta estructura de heterocromatina ya está establecida en las células madre embrionarias (ES) en circunstancias normales, es de vital importancia examinar este proceso en las células ES FSHD. Esto sería importante para comprender cómo se ve comprometido el establecimiento de la heterocromatina durante el desarrollo y, como resultado, qué genes se ven afectados. Sin embargo, actualmente no hay células FSHD ES disponibles. Familias generosas y valientes con FSHD en su historia donaron embriones fertilizados in vitro para uso en investigaciones con la esperanza de mejorar la vida de los pacientes con FSHD en el futuro. Por lo tanto, nuestro principal objetivo es establecer líneas celulares FSHD ES no sólo para nuestra investigación, sino también para su uso en la comunidad de investigación de FSHD. Esperamos optimizar un protocolo para diferenciar estas células en células de músculo esquelético para un análisis comparativo entre células ES normales y FSHD durante el desarrollo. Creo que el proyecto propuesto hará contribuciones significativas a la comprensión de la etiología y patogénesis de la FSHD, así como también al posible desarrollo de estrategias terapéuticas para mejorar el funcionamiento físico de los pacientes con FSHD.

Declaración de beneficio para California:

La distrofia facioescapulohumeral (FSHD) es la tercera distrofia muscular hereditaria más común en los Estados Unidos. California es el estado más representado en los EE. UU. en términos de membresía en la Sociedad FSH. Casi 250 familias en California con un promedio de 3 a 4 miembros afectados por familia pertenecen a la Sociedad FSH, lo que se traduciría en un total de 750 a 1,000 pacientes registrados. Se informa que la FSHD tiene una incidencia de 1 en 20,000. Sin embargo, la Sociedad estima que la incidencia real es probablemente considerablemente mayor, con una incidencia probable de 1/7,000. Esta estimación más alta se basa en la opinión de expertos médicos de que la FSHD es al menos tres veces más prevalente debido a un diagnóstico erróneo, lo que refleja la dificultad asociada con reconocer a aquellos pacientes con una presentación clínica leve de la enfermedad. Esto concuerda con la opinión de algunas personas que rastrean los casos de FSHD de que las técnicas mejoradas de diagnóstico molecular brindarán una evaluación más precisa de toda la gama de esta enfermedad en la población. Dado que esta enfermedad se hereda de forma dominante, una familia numerosa puede tener un número significativo de personas afectadas. En un caso documentado, una familia de 2,500 personas cuyo origen se remonta a un colono que tenía FSHD tenía entre 1600 y 1700 miembros afectados, muchos de los cuales finalmente se mudaron a California. Muchas familias afectadas por esta enfermedad se muestran reacias a acudir a buscar ayuda y, por lo tanto, no están incluidas en las listas de miembros de la Sociedad FSH. La FSHD no es necesariamente letal y muchos pacientes deben vivir y afrontar una discapacidad progresiva a lo largo de su vida sin ningún tratamiento eficaz. No existe un tratamiento eficaz porque el mecanismo de la enfermedad no está claro. El hecho de que las extremidades superiores estén predominantemente afectadas sugiere que la anomalía puede iniciarse durante el desarrollo embrionario. Por lo tanto, el proyecto propuesto para obtener células ES FSHD es fundamental para estudiar este momento crucial en la manifestación de la enfermedad. Planeamos poner estas células a disposición de los científicos en el campo de la FSHD para facilitar aún más la investigación de muchos aspectos diferentes de la patogénesis de la FSHD. También esperamos que estas células se conviertan en reactivos valiosos para el desarrollo de mejores diagnósticos moleculares, así como para fomentar nuevas ideas sobre posibles estrategias de tratamiento. El objetivo principal es ofrecer nuevos conocimientos para mejorar las vidas de muchos pacientes de FSHD en California y en toda la comunidad internacional.

Publicaciones

PLoS Genet (2009): La pérdida específica de la trimetilación de la histona H3 lisina 9 y la unión de HP1gamma/cohesina en las repeticiones D4Z4 se asocia con la distrofia facioescapulohumeral (FSHD). (PubMed: 19593370)