Imágenes de lapso de tiempo correlacionadas y análisis molecular unicelular del desarrollo de embriones humanos

Como se señaló en nuestra solicitud, el desarrollo de embriones humanos no se comprende bien a pesar de su importancia central para nuestra comprensión de los programas y mecanismos naturales de la reprogramación nuclear humana y las decisiones sobre el destino celular, temas críticos para la biología de las células madre y la medicina regenerativa. Por lo tanto, buscamos abordar la hipótesis de que el conocimiento del desarrollo de embriones humanos puede traducirse en mejores aplicaciones clínicas tanto en medicina reproductiva como regenerativa. Además, planteamos la hipótesis de que los programas nativos de la transición del ovocito humano al embrión pueden informar nuestra comprensión y prácticas en la biología de las células madre pluripotentes humanas. Propusimos tres objetivos para abordar nuestra hipótesis, de la siguiente manera: Objetivo específico 1) Examinar los programas genéticos del desarrollo para identificar los factores necesarios para activar el genoma embrionario humano. Aquí, propusimos descubrir las relaciones entre los parámetros de imagen, los programas de ARNm, especialmente la degradación y EGA, y los programas epigenéticos. Probamos la hipótesis de que la destrucción de los ARN maternos ocurre simultáneamente con la remodelación epigenética y es un requisito previo para EGA a través del modelado. Objetivo específico 2) Determinar la relación entre los parámetros predictivos de imágenes y la aneuploidía. Aquí propusimos examinar la relación entre el comportamiento de las células embrionarias y la composición cromosómica subyacente y luego desarrollar un algoritmo completamente automatizado que permita el diagnóstico no invasivo de la viabilidad y la aneuploidía en células individuales. Objetivo específico 3) Ampliar nuestros hallazgos a las células madre pluripotentes humanas. Hemos logrado avances sustanciales en los tres objetivos, en particular al examinar los programas epigenéticos de embriones humanos, examinar la relación entre aneuploidía y comportamiento de imágenes y derivar métodos susceptibles de detectar nuevos factores que puedan afectar las características de la línea pluripotente.

Propusimos tres objetivos: aumentar el conocimiento de los aspectos básicos del desarrollo de embriones humanos antes de la implantación, proporcionar el primer examen del comportamiento celular de los blastómeros aneuploides y utilizar la embriología para ayudar en la producción/diagnóstico de líneas celulares pluripotentes "estándar de oro". Los resultados del primer objetivo continuaron los del año pasado, con estudios para sondear funcionalmente los requisitos para la activación del genoma embrionario humano. Los resultados indican que los patrones de modificaciones en el desarrollo de embriones humanos son muy similares a los de los ratones, pero también demuestran diferencias importantes. El momento y la reproducibilidad de los patrones de metilación e hidroxilo (modificaciones del ADN) nos sugirieron un papel clave en el desarrollo embrionario, y la herencia probablemente sea materna en los primeros días. Por lo tanto, hemos reducido la expresión materna de actores clave durante la transición de ovocito murino a embrión para investigar la relación con la activación global del genoma y la activación de programas específicos. Los resultados indican un papel fundamental en la progresión del desarrollo embrionario, produciéndose una detención en aquellos con expresión reducida. En el segundo objetivo, ampliamos nuestros estudios desde el año 1 que se habían centrado en imágenes hasta la etapa de 4 células, para abarcar imágenes del desarrollo hasta la etapa de blastocisto. Realizamos imágenes de lapso de tiempo no invasivas de embriones humanos desde el cigoto hasta la etapa de blastocisto y análisis cromosómico mediante biopsia de trofectodermo e hibridación genómica comparativa de matrices (A-CGH). Demostramos la variedad de aneuploidías que son compatibles con el desarrollo de blastocistos y demostramos que los parámetros del ciclo celular previamente identificados que predicen la formación de blastocistos también predicen fuertemente la ploidía de los blastocistos. Además, identificamos varios parámetros de imágenes no invasivos más allá del día 2 que también se correlacionaban con el estado de ploidía del blastocisto. Un subconjunto de parámetros también predice en gran medida la calidad del blastocisto y, por tanto, puede ayudar en la selección de embriones. En conjunto, nuestros hallazgos del último año sugieren que el desarrollo del embrión humano se caracteriza por una sincronización precisa en las ventanas de desarrollo; sin embargo, los embriones aneuploides han alterado el tiempo, lo que sugiere una perturbación de procesos clave del ciclo celular. Es probable que el ensamblaje de una gran base de datos de embriones humanos permita describir los límites de estos parámetros junto con el desarrollo humano normal. Finalmente, según nuestros estudios, como se informó en el primer año, buscamos utilizar la reprogramación de ARNm para permitir la máxima flexibilidad en la reprogramación con factores novedosos. Sólo unos pocos estudios han abordado las propiedades moleculares y funcionales de las iPSC que pueden predisponer la contribución a la línea germinal en ratones o humanos. Como se señaló, hemos obtenido iPSC libres de integración mediante el uso de ARNm modificados que codifican los factores de Yamanaka (OSKM) solos o en combinación con el ARNm específico de células germinales, VASA, que codifica una proteína de unión a ARN (OSKMV). El perfil de expresión genética global no pudo distinguir entre las iPSC OSKM y OSKMV y solo se observaron diferencias sutiles en la expresión de genes específicos de células germinales, perfiles epigenéticos y estudios de diferenciación in vitro. Luego ampliamos nuestros estudios del último período de financiación y trasplantamos iPSC OSKM y OSKMV indiferenciadas a túbulos seminíferos de ratón. Observamos que el xenoinjerto de células OSKM y OSKMV indiferenciadas dio como resultado la producción de células germinales humanas en túbulos seminíferos de ratón; la diferenciación de las células germinales va más allá de lo que se había observado previamente con una extensa colocalización de marcadores, de las células a la membrana basal y otras características de las células germinales. Además, las células OSKMV y OSKM diferían en su comportamiento, especialmente en lo que respecta al desarrollo de masas celulares (tumores) que podrían alterar la función testicular. Los estudios destacan los destinos divergentes relacionados con las iPSC derivados de la expresión exógena de diferentes factores. En general, los estudios combinan enfoques básicos y traslacionales y están produciendo resultados novedosos importantes para el desarrollo humano, el diagnóstico de aneuploidías y la derivación de nuevas líneas de células madre pluripotentes.

Propusimos tres objetivos: aumentar el conocimiento de los aspectos básicos del desarrollo de embriones humanos antes de la implantación, proporcionar el primer examen del comportamiento celular de los blastómeros aneuploides y utilizar la embriología para ayudar en la producción/diagnóstico de líneas celulares pluripotentes "estándar de oro". Durante el transcurso de la subvención, hemos investigado funcionalmente los requisitos para la activación del genoma embrionario humano (determinantes tanto genéticos como epigenéticos), examinamos la expresión genética en embriones individuales y blastómeros individuales de embriones, examinamos las correlaciones entre los parámetros del ciclo celular determinados por métodos no genéticos. imágenes invasivas e identificaron ARN no codificantes intergénicos largos (lincRNA) que se expresan específicamente en embriones humanos y mejoran la reprogramación. En general, los estudios arrojan mucha luz sobre el desarrollo normal y aberrante de embriones humanos y se han traducido en estudios de derivación y diferenciación de células madre pluripotentes.