Construyendo un mapa del destino del embrión humano

El objetivo de nuestro trabajo es comprender cómo ocurren las etapas iniciales del desarrollo humano. Aunque la comunidad científica ha aprendido mucho sobre los factores que controlan las primeras decisiones de desarrollo en organismos modelo como los ratones, se sabe muy poco sobre los procesos paralelos en los humanos. Gran parte de lo que hemos aprendido sugiere que existen similitudes y diferencias fundamentales, pero su alcance permanece en gran medida inexplorado. Fuimos a mapear este territorio inexplorado. ¿Cómo abordaremos esta cuestión científica? Estamos estudiando los primeros días del desarrollo humano haciendo crecer embriones y estudiando sus propiedades físicas y moleculares. Brevemente, parejas donaron embriones humanos congelados, aproximadamente del tamaño de la cabeza de un alfiler pequeño, al Banco de Embriones y Gametos de la UCSF al finalizar los tratamientos de fertilidad. Después de obtener el consentimiento informado por escrito, utilizamos estos embriones tempranos en nuestros estudios. Cuando se cultivan en las condiciones adecuadas, continúan desarrollándose, expandiéndose de dos células a agregados que contienen cuatro, ocho, dieciséis y, finalmente, hasta 100 células sin aumentar su tamaño. Este proceso imita lo que creemos que sucede durante los primeros días de un embarazo real. Así, al estudiar los cambios que se producen durante los primeros días del desarrollo embrionario humano en el laboratorio, creemos que comprenderemos mucho mejor este proceso. Durante el período de subvención actual, logramos un gran progreso hacia el logro de nuestros objetivos generales. Con respecto al estudio de las propiedades físicas de los embriones, demostramos que entre la etapa de desarrollo de 8 células y la de 16 células, las células componentes comienzan a segregarse en función de su capacidad para unirse entre sí. Las células de la superficie exterior del embrión se adhieren firmemente entre sí. También tienen una orientación distinta con marcadores morfológicos y moleculares distribuidos de forma asimétrica y sistemática en un extremo o en el otro. Una vez que las células desarrollan estas especializaciones, pensamos que están destinadas a formar la placenta, que une a la descendencia al útero y apoya su desarrollo durante el resto del embarazo. Por el contrario, las células del interior del embrión, que no logran desarrollar estas especializaciones, pasan a formar la llamada "masa celular interna" que se desarrolla en la descendencia. El año que viene, queremos poner estos nuevos hallazgos en un contexto molecular. Específicamente, queremos determinar si la orientación de las células que forman la superficie exterior del embrión ocurre antes o después de que las células comiencen a expresar marcadores que sugieren que han asumido un destino placentario. Estos experimentos nos ayudarán a comprender si la orientación o las firmas moleculares son los principales impulsores de esta decisión de desarrollo inicial. También estamos interesados ​​en la interacción de estas dos fuerzas en relación con la diferenciación continua de las células que pasan a formar componentes de la masa celular interna y, posteriormente, todas las células de la descendencia. ¿Cuáles son las implicaciones prácticas de este trabajo? Creemos que los investigadores de células madre utilizarán nuestros hallazgos para optimizar los protocolos para diferenciar las células madre embrionarias humanas a lo largo de los principales linajes. Actualmente, sabemos que los protocolos más sólidos para generar muchos tipos de células (p. ej., cardiomiocitos/músculos, neuronas, células beta pancreáticas) implican desencadenar procesos de diferenciación gradual que recapitulan lo que sucede durante el desarrollo normal. La hoja de ruta que se utiliza generalmente se ha elaborado utilizando modelos animales. Creemos que será muy importante obtener información equivalente sobre las primeras etapas del desarrollo embrionario humano, que pueda usarse para personalizar estos protocolos para la generación de terapias diferenciadas basadas en células humanas. Nuestro trabajo también tiene relevancia para el tratamiento de la infertilidad humana. Por ejemplo, es muy difícil discernir cómo podría estar fallando el desarrollo embrionario cuando no sabemos casi nada sobre los procesos normales análogos. Por lo tanto, prevemos que los resultados de nuestro trabajo puedan usarse como telón de fondo para desarrollar correlatos moleculares de la calidad de los embriones que puedan usarse para identificar el subconjunto con el mejor potencial para un mayor desarrollo. Creemos que la capacidad de reconocer y transferir estos embriones ayudará a mejorar las tasas de embarazo en las parejas que buscan tecnologías de reproducción asistida. Finalmente, establecer puntos de referencia durante los primeros días del desarrollo humano nos ayudará a optimizar las condiciones de crecimiento de los embriones humanos, una consideración importante ya que el objetivo es replicar lo más fielmente posible el entorno en el que normalmente tienen lugar estos pasos iniciales del desarrollo. En resumen, estamos avanzando mucho en la comprensión de las etapas iniciales del desarrollo humano. Hasta ahora, nuestros datos sugieren que las reglas que se han aprendido estudiando modelos animales se han modificado o reinventado en nuestra especie. Nuestro trabajo continuo iluminará aún más este principio.

El trabajo de nuestro grupo apunta a la interesante conclusión de que la diferenciación durante las primeras etapas del desarrollo embrionario humano puede ocurrir antes de que cualquier especialización morfológica sea evidente. Nuestra primera pista de que esto podría estar sucediendo provino de una serie de análisis microscópicos de alta definición y gran aumento en los que examinamos en detalle las células de embriones humanos de cinco días. Los resultados fueron sorprendentes. En concreto, las células del interior del embrión que van formando todo el cuerpo no tienen un aspecto idéntico. En cambio, parecen tener especializaciones únicas. Por ejemplo, el tamaño del núcleo que contiene el ADN de una célula es variable, al igual que el grado de condensación del ADN, que es una estimación de su actividad. Estos hallazgos nos llevaron a sospechar que las células del embrión temprano podrían tener un potencial de desarrollo desigual, la principal teoría que explora nuestro proyecto. Durante el período de financiación actual, logramos grandes avances para probar esta hipótesis. Nos centramos en un conjunto de 10 líneas de células madre embrionarias humanas que derivamos de células individuales de cinco embriones humanos hermanos de 8 células. En dos casos, varias células del mismo embrión produjeron líneas. Por lo tanto, esta colección consta de miembros genéticamente idénticos o muy similares genéticamente. En una serie de experimentos, perfilamos los genes que expresan estas líneas y los comparamos en todo el conjunto. Los resultados de este análisis sugirieron que algunas de las células se encontraban en diferentes etapas de desarrollo cuando fueron extraídas del embrión con el fin de derivar la línea. Curiosamente, los genes expresados ​​diferencialmente incluían reguladores maestros del desarrollo y componentes estructurales importantes que están vinculados a la identidad de una célula. Nuestro objetivo para el próximo año es determinar si podemos encontrar evidencia temprana de diferenciación en embriones humanos, lo que sugeriría que los cambios que estamos observando en las células que se han mantenido en el laboratorio en realidad están ocurriendo durante el desarrollo temprano normal. También estábamos interesados ​​en determinar si nuestras líneas, que se derivaron de células individuales extraídas de embriones humanos en etapas muy tempranas, funcionan de manera diferente a la mayoría de las líneas de células madre embrionarias humanas que se produjeron a partir de embriones en etapas posteriores. Para abordar esta pregunta, estudiamos la expresión de moléculas asociadas con el primer proceso de diferenciación que establece que el destino de las células embrionarias tempranas contribuye al cuerpo o a la placenta. Este último órgano transitorio conecta a la descendencia con la madre y apoya su desarrollo antes del nacimiento. Los experimentos iniciales mostraron que las líneas diferían en la expresión de moléculas asociadas con el establecimiento del destino placentario. Entre ellos se encontraba la gonadotropina coriónica humana, que se analiza para determinar si una mujer está embarazada. Este hallazgo sugirió que algunas de las líneas son más capaces de contribuir al desarrollo placentario en comparación con la formación de la descendencia. Para investigar más a fondo esta posibilidad, cultivamos líneas derivadas de células individuales extraídas de un solo embrión en condiciones que estimulan el desarrollo placentario. Descubrimos que estas células madre embrionarias humanas comenzaron a expresar marcadores que normalmente se asocian con los primeros pasos que establecen la identidad placentaria. A medida que continuaba la diferenciación, las células comenzaron a expresar otros factores placentarios que fundamentaron nuestra teoría de que estas líneas eran capaces de formar estructuras tanto embrionarias como placentarias. Por lo tanto, creemos que la obtención de líneas de células madre embrionarias humanas a partir de células individuales que se eliminan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario produce líneas que tienen un potencial de desarrollo ampliado en comparación con las líneas que se derivan por medios convencionales de embriones en etapas posteriores. Creemos que nuestros hallazgos tienen implicaciones interesantes. A nivel científico básico, los conjuntos de genes que las nuevas líneas expresan de manera diferencial en comparación con otras líneas de células madre embrionarias humanas podrían darnos pistas importantes sobre los factores que están activos durante las etapas iniciales cruciales del desarrollo humano. Estamos muy interesados ​​en probar la función de estas moléculas, que, según nuestra teoría, desempeñan funciones importantes. Nuestros datos también añaden nueva información con respecto a las diferencias entre el potencial de desarrollo de las líneas de células madre embrionarias humanas existentes. Por ejemplo, pueden ser multipotentes con un potencial relativamente limitado, pluripotentes con la capacidad de diferenciarse en todas las células del cuerpo, o totipotentes con la capacidad de formar tanto la placenta como la descendencia. Nuestros resultados sugieren que las líneas de células madre embrionarias humanas derivadas de embriones en etapas muy tempranas están más cerca de un estado totipotente, lo que podría hacerlas más aptas para la diferenciación posterior en muchos tipos de células, una teoría que exploraremos durante el próximo año.

Durante el año pasado, el trabajo de nuestro grupo financiado por este premio CIRM se centró en tres nuevos sistemas de células madre humanas. La primera fue una colección de 10 líneas de células madre embrionarias humanas que derivamos de células individuales, denominadas blastómeras, de embriones humanos en etapa muy temprana. Se cultivaron durante tres días en el laboratorio, momento en el que contaban con ocho células. Gran parte de nuestro trabajo, que se describe a continuación, sugiere que estas células tienen propiedades únicas en comparación con las líneas de células madre embrionarias humanas que se derivan por medios convencionales, es decir, de embriones intactos que se cultivan durante cinco a seis días en el laboratorio y se componen de aproximadamente cien células. Es de destacar que estas líneas se enviaron al Registro de los NIH en diciembre de 2009. Se nos notificó que no se ajustaban a la definición federal de línea de células madre embrionarias humanas, que incluye derivar de un embrión de cinco a seis días de edad. Por lo tanto, se abrió un período de comentarios a través del Registro Federal con respecto a un cambio propuesto en la definición de hESC como provenientes de embriones tempranos hasta la etapa de 5 a 6 días inclusive. En este momento, los NIH todavía están considerando los comentarios del público. Por lo tanto, los NIH no pueden revisar para el registro nuestras nuevas líneas que se derivaron de blastómeros individuales y el trabajo que emplea este nuevo modelo celular no es elegible para financiamiento federal. Por lo tanto, nuestros experimentos no serían posibles sin la financiación del CIRM. Recientemente, nos centramos en comparar los patrones globales de expresión genética de las líneas. Estas “huellas moleculares” nos dan pistas importantes sobre las diferencias en su potencial con respecto a la formación de los diversos tipos de células que se prevén para su uso en terapias de medicina regenerativa. Por ejemplo, algunas de las líneas expresan niveles muy altos de moléculas que sólo son producidas por neuronas. Otros parecen estar adquiriendo las características de las células del músculo cardíaco o del hígado. Creemos que este hallazgo es importante porque debería ser más fácil crear tipos de células diferenciadas particulares, como las del páncreas, a partir de líneas que ya están predispuestas a diferenciarse por esta vía. En experimentos adicionales, probamos la teoría de que las huellas moleculares individuales de las líneas derivadas de blastómeros eran una instantánea de las diferencias que podían observarse en embriones humanos en etapas equivalentes a aquellas de las que se derivaban las líneas. Por lo tanto, detectamos moléculas que se expresaban diferencialmente entre las líneas. En varios casos, observamos expresión sólo en un subconjunto de las ocho células que componen los embriones de tres días. Esto es evidencia de que, en los humanos, el reloj del desarrollo corre a un ritmo rápido y la diferenciación es evidente en una etapa más temprana de lo que se pensaba anteriormente. Este hallazgo sugiere que los embriones en etapas posteriores de los cuales se han derivado casi todas las líneas de células madre embrionarias humanas existentes pueden estar compuestos por células que se han diferenciado aún más. El segundo nuevo sistema de células madre humanas fueron los progenitores comprometidos aislados de placentas humanas de gestación temprana. Estábamos muy interesados ​​en localizar la ubicación de las células, lo que nos permitió idear procedimientos para purificarlas. Luego utilizamos la información que nuestro grupo y otros investigadores han generado sobre las señales que permiten su autorrenovación para idear condiciones que respalden el crecimiento continuo de estos progenitores en el laboratorio. El nuevo modelo progenitor nos permitirá estudiar aspectos importantes del desarrollo placentario humano que antes eran inaccesibles. Este trabajo es importante porque la placenta juega un papel importante en la regulación del resultado del embarazo. Por ejemplo, este órgano transitorio utiliza un proceso invasivo inusual similar a un tumor para anclar al bebé en desarrollo al útero. Además, la placenta transfiere nutrientes y desechos hacia y desde la sangre materna, respectivamente. Así, con este nuevo modelo podremos estudiar la formación y la función de las células que realizan estas importantes tareas. El tercer nuevo modelo de células madre humanas surgió de nuestro descubrimiento de que las líneas descritas anteriormente, que se derivaron de embriones humanos en etapas muy tempranas, podrían formar espontáneamente células madre placentarias humanas, es decir, los precursores de las etapas más tempranas que finalmente dan lugar a células madre placentarias comprometidas. progenitores. Utilizamos nuestro conocimiento sobre cómo mantener estas últimas células para diseñar condiciones que permitan el crecimiento de esta población en el laboratorio. Actualmente, estamos perfeccionando métodos que permitirán su continua autorrenovación. También estamos llevando a cabo un análisis detallado de su potencial de desarrollo. Además, queremos establecer bancos de células para distribuirlas a nuestros colegas que también están estudiando los mecanismos básicos del desarrollo placentario humano. Finalmente, completamos experimentos en los que ideamos un método novedoso para cultivar células madre embrionarias humanas que no requiere su exposición a otros tipos de células, una fuente potencial de infección. Descubrimos una molécula que podría sustentarlos.

Este es nuestro informe final. Nuestro objetivo general era conocer mejor los primeros pasos del desarrollo humano, que comienza con una célula y termina con la formación de todo el cuerpo. Este es un proceso muy complicado y difícil de entender si sólo estudiamos los pasos del terminal. Teorizamos que empezando desde el principio, muy cerca de la etapa unicelular, podríamos reconstruir la base molecular sobre la que se construye el plan corporal. Creemos que esta información es crucial para diseñar terapias de medicina regenerativa. Debemos poder programar células madre humanas que se encuentran en las primeras etapas del desarrollo continuo en una progenie diferenciada que pueda integrarse en órganos y tejidos completamente formados con fines de reparación. Si entendemos, a nivel molecular, los procesos que originalmente dieron origen a los tipos de células especializadas, entonces podremos reproducirlos en el laboratorio, generando células para trasplantarlas a pacientes. Logramos todos los objetivos que se establecieron en nuestra solicitud original. Propusimos un análisis sistemático de los primeros pasos del desarrollo humano. Primero, utilizamos técnicas de microscopía de alta potencia para realizar un examen detallado de embriones humanos. Las dejamos desarrollar durante 6 días en el laboratorio. En este punto, el embrión redondo, que tiene aproximadamente el tamaño de la cabeza de un alfiler, consta de dos tipos de células. Un tipo, que se encuentra en la superficie, está destinado a formar la placenta, que conecta físicamente a la descendencia con la madre y regula la transferencia de sustancias a la descendencia. El otro tipo, un pequeño grupo de células en un extremo del interior del embrión, forma el cuerpo completo. Cuando examinamos los componentes de este grupo con un aumento muy alto vimos que las células individuales se veían bastante diferentes entre sí y algunas tenían características maduras. Esto fue una sorpresa porque exámenes similares de embriones en la misma etapa de otras especies han demostrado que estos grupos están compuestos por células que todas parecen iguales con estructuras bastante primitivas, lo que sugiere que son funcionalmente muy similares. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que las etapas iniciales del desarrollo embrionario humano pueden estar en un camino más rápido que el observado en modelos animales. ¿Cómo podríamos probar esta teoría? Dado que trabajamos en la especie humana, tenemos un número limitado de enfoques disponibles y tuvimos que pensar en nuevas formas de abordar esta cuestión. Por lo tanto, decidimos aprovechar el hecho de que, trabajando con colegas, ayudamos a desarrollar métodos para derivar líneas de hESC a partir de células individuales de embriones humanos en etapa temprana que se cultivaron durante solo unos días en el laboratorio. Este método tiene muchas ventajas en comparación con los enfoques convencionales que se han utilizado para establecer casi todas las líneas con las que trabajan los científicos. Por ejemplo, conocemos la célula precisa que generó la línea y su edad (en días) en el momento de la derivación. Esta información es difícil de obtener cuando las hESC se derivan de embriones humanos intactos de 6 días de edad que ahora pensamos que podrían estar compuestos por muchos tipos de células. Al realizar un cambio en este método, lo hicimos muy eficiente. En concreto, tuvimos en cuenta el hecho de que las células del interior del embrión residen en grupos. Por lo tanto, cuando cultivamos células individuales extraídas de embriones, intentamos recrear este entorno intercalándolas en las moléculas que normalmente las rodean. Usando este método, extrajimos de 8 a 12 células de cada uno de los 5 embriones que habían sido cultivados en el laboratorio durante 3 días. Diez de estas células dieron lugar a líneas hESC. Un embrión produjo 4 líneas (UCSFB1-4), un segundo embrión dio 3 líneas (UCSFB5-7) y 3 embriones dieron una línea cada uno (UCSFB8, UCSFB9 y UCSFB10). Los 5 embriones fueron donados por una pareja. Por lo tanto, las líneas estaban relacionadas genéticamente como lo están los hermanos o eran idénticas, es decir, trillizos y cuatrillizos. Las líneas fueron registradas en CIRM y están pendientes de aprobación por parte de los NIH. ¿Qué aprendimos de esta colección de células? En primer lugar, comparamos sus patrones de expresión genética, un código de barras que consta de unos 25,000 elementos y que es exclusivo de cada tipo de célula. Descubrimos que estas células tenían códigos de barras diferentes de las líneas hESC derivadas de métodos convencionales. Curiosamente, cada línea celular tenía un código de barras diferente incluso si se establecieron a partir de células extraídas del mismo embrión. Esto sugirió que las líneas podrían haber conservado diferencias que estaban presentes desde el principio. Para probar esta teoría, buscamos las mismas diferencias en grupos de células de embriones humanos en etapa temprana y las encontramos. Esta es una evidencia adicional que respalda nuestra teoría de la vía rápida del desarrollo embrionario humano y nos brinda información sobre las moléculas involucradas, es decir, las porciones del código de barras expresadas diferencialmente. Creemos que esta información será muy útil para orientar la producción de tipos de células específicos que se utilizarán en terapias de medicina regenerativa.