Herramientas celulares para estudiar enfermedades cerebrales que afectan la transmisión sináptica

Durante este primer año de nuestro proyecto nos hemos centrado principalmente en probar varios métodos para diferenciar directamente las células ES humanas en neuronas. Como se describe con más detalle a continuación, tuvimos mucho éxito y desarrollamos formas de diferenciar líneas de células madre humanas en células neuronales con alta pureza y buenas características de maduración. Por ejemplo, podemos analizar las corrientes eléctricas en estas células, que son propiedades funcionales importantes de las neuronas, y observamos que estas células se comportan de hecho como las neuronas del cerebro. Más concretamente, las células fueron capaces de generar potenciales de acción necesarios en el cerebro para transmitir información de una neurona a otra así como formar sinapsis, que son las estructuras que conectan las diferentes neuronas entre sí. Debido a la diferenciación de diferentes Las líneas de células madre deben ser sólidas y reproducibles. Dedicamos mucho tiempo a optimizar el protocolo y probamos muchas líneas de células madre diferentes. Esto reveló un alto grado de reproducibilidad y pureza de las células nerviosas derivadas de células madre y hemos probado células madre embrionarias humanas (es decir, células madre derivadas del embrión), así como células pluripotentes inducidas (iPS) (es decir, células madre reprogramadas a partir de células madre humanas). celúlas de piel). Es tranquilizador que el mismo método funcione en todas estas líneas celulares con dinámicas y propiedades funcionales de las células nerviosas muy similares. También hemos logrado avances significativos para convertir los fibroblastos humanos en células nerviosas directamente y sin pasar por un estado intermedio de células iPS. Hemos identificado un factor neuronal llamado NeuroD1 como cofactor crítico que, además de los tres factores que habíamos identificado anteriormente, funciona en ratones. Esos 4 factores juntos ahora permitieron la generación de células "neuronales inducidas" (iN) completamente funcionales a partir de fibroblastos de prepucio humano tanto fetales como posnatales tempranos. También hemos probado varias moléculas pequeñas para intentar aumentar la eficiencia de la reprogramación. Finalmente, hemos generado algunos componentes esenciales que nos permitirán estudiar el Síndrome de Rett utilizando estas tecnologías que se están desarrollando al mismo tiempo (descritas anteriormente). En el último año hemos generado varias líneas de células iPS de pacientes con síndrome de Rett y estamos en el proceso de caracterizarlas por completo. Planeamos aplicar pronto nuestro protocolo de diferenciación optimizado a estas células, así como a las células de control, para buscar cualquier posible rasgo de enfermedad que distinga a las células de los pacientes y los controles.

La generación de células madre pluripotentes humanas a partir de embriones descartados (células madre embrionarias o células ES) y directamente a partir de células de la piel mediante reprogramación (células madre pluripotentes inducidas o células iPS) es muy prometedora y puede revolucionar el estudio de las enfermedades humanas. En particular, la posibilidad principal de convertir estas células madre en neuronas completamente funcionales proporcionaría una nueva plataforma celular que proporcionaría un excelente acceso experimental para estudiar neuronas humanas derivadas de controles sanos o de individuos enfermos. Sin embargo, el objetivo de obtener neuronas maduras a partir de estas poblaciones de células madre aún no se ha logrado. Si bien se han desarrollado muchas formas de instruir a estas células madre en neuronas específicas e incluso subtipos neuronales, estos protocolos de diferenciación tardan muchos meses en completarse, son laboriosos y, lo más importante, no producen neuronas completamente maduras. Recientemente hemos descubierto una manera de convertir células de la piel de recién nacidos humanos directamente en neuronas funcionales, pero las eficiencias eran bajas y además la mayoría de estas células neuronales inducidas aún estaban inmaduras. El objetivo de este proyecto es mejorar estos métodos y desarrollar herramientas que realmente permitan la generación de neuronas humanas maduras. Propusimos abordar este problema de dos maneras diferentes y complementarias: (1) Propusimos aplicar los métodos que utilizamos para convertir células de la piel humana en neuronas a ambas poblaciones de células madre (células ES e iPS). (2) Propusimos mejorar aún más la conversión directa de células de la piel en células neuronales inducidas mediante la evaluación sistemática de las condiciones de cultivo y moduladores de moléculas pequeñas solos y en combinación. Finalmente, propusimos aplicar nuestras herramientas recién derivadas para estudiar una enfermedad infantil común relacionada con el autismo, llamada síndrome de Rett, que afecta exclusivamente a niñas, que experimentan un desarrollo y una maduración cerebral normales, pero que después de un período de meses a años presentan retraso en el desarrollo y en algunos casos, graves deficiencias sociales y de comportamiento. Estamos muy contentos de poder informar que hemos logrado un gran progreso hacia el desarrollo de las herramientas propuestas y ahora estamos comenzando a aplicarlas al estudio del síndrome de Rett según lo propuesto. En particular, hemos perfeccionado la aplicación de la técnica para convertir células madre humanas en células neuronales inducidas completamente funcionales. Con este enfoque estamos listos para investigar la conectividad eléctrica detallada de los circuitos neuronales en células neuronales inducidas en condiciones de enfermedad y no enfermedad. También hemos logrado buenos avances con el segundo enfoque y hemos demostrado que es posible mejorar significativamente las eficiencias de conversión utilizando inhibidores de moléculas pequeñas y cambiando la concentración de oxígeno ambiental. Actualmente estamos explorando si estas eficiencias son lo suficientemente altas como para permitir el modelado de enfermedades mientras continuamos optimizando los métodos de cultivo.

Hemos generado una nueva herramienta para estudiar la función cerebral a nivel celular. La diferenciación de células madre pluripotentes, como las embrionarias o las pluripotentes inducidas, en células nerviosas funcionales (neuronas) sigue siendo un desafío. Aquí demostramos que los factores específicos que normalmente regulan el desarrollo del cerebro pueden aprovecharse para "acelerar" la diferenciación de las células madre humanas en neuronas. Dado que estas neuronas se inducen utilizando factores exógenos, las llamamos "células neuronales inducidas" o, en resumen, células "iN". Las células iN derivadas de células madre muestran todas las propiedades funcionales principales de las neuronas, es decir, pueden comunicarse entre sí (formar sinapsis) y utilizar señales eléctricas para transmitir información (capacidad de generar potenciales de acción). En tan solo 2 o 3 semanas se pueden establecer redes neuronales completamente funcionales utilizando estas neuronas humanas. Luego demostramos que diferentes combinaciones de factores producen diferentes tipos de neuronas, lo que nos permite reconstruir mezclas de células complejas que se asemejan a las de cultivos neuronales normales. También mostramos que las células iN son sustitutos útiles que informan rasgos de enfermedades a nivel celular. En particular, demostramos que una mutación genética asociada con la esquizofrenia conduce a un defecto funcional mensurable en las células iN humanas. Esto podría conducir a nuevos métodos importantes para encontrar tratamientos para estas enfermedades devastadoras.