Las líneas celulares iPS muestran una alta variabilidad con respecto a sus propiedades de crecimiento, capacidad de diferenciación y manifestación del fenotipo de la enfermedad; Este es un desafío importante tanto para el modelado de enfermedades in vitro como para la detección de fármacos, así como para la terapia de reemplazo celular. Actualmente se desconoce la causa de esta variabilidad y se ha propuesto que la heterogeneidad de la población inicial de fibroblastos, la composición de los factores de reprogramación y la integración viral en el genoma contribuyen a la variabilidad entre diferentes clones de iPSC derivados de la misma población inicial. En particular, se sugirió que el uso de vectores virales de ADN para administrar los factores de reprogramación era el obstáculo clave para el eventual uso de iPSC en terapias de reemplazo celular. Recientemente, se han desarrollado varios métodos para obtener células iPS sin integración, pero en su mayoría adolecen de una eficiencia de reprogramación inaceptablemente baja o de una entrega de factores de reprogramación que requiere mucha mano de obra. El objetivo de este trabajo es producir células iPS sin integración con alta eficiencia. Hasta la fecha, hemos desarrollado una plataforma de alto rendimiento para detectar moléculas pequeñas que mejoran la reprogramación en presencia de tres factores de transcripción necesarios para la reprogramación de células de fibroblastos: KLF3, SOX4 y OCT2. Estos esfuerzos incluyeron el desarrollo de ensayos, la caracterización de nuestras líneas celulares estables diseñadas que expresan factores de reprogramación bajo el control de un promotor inducible y la optimización para la detección de alto rendimiento. Seleccionamos más de 4 compuestos de nuestra biblioteca de moléculas pequeñas, que comprenden compuestos con una amplia diversidad química y que cubren múltiples clases de objetivos celulares. Identificamos 100,000 candidatos exitosos en nuestra selección primaria; sin embargo, en los ensayos de seguimiento ninguno de estos compuestos mostró un efecto comparable al de un compuesto de control positivo. En el futuro, planeamos una caracterización detallada de otros métodos de reprogramación sin integración para determinar las diferencias entre los métodos integradores y no integrados para reprogramar fibroblastos. Evaluaremos la calidad y variabilidad de las líneas celulares iPS, así como su potencial y variabilidad de diferenciación y manifestación del fenotipo de la enfermedad en iPSC libres de integración, y las compararemos con iPSC derivadas de virus de ADN. Nuestros resultados deberían contribuir a la comprensión de la fuente de variabilidad entre las células iPS y acercarnos a alcanzar el objetivo final: la producción de células iPS humanas libres de integración con alta eficiencia.

Período de información:

Los estudiantes de Year 2

El uso de la tecnología de células madre para estudiar enfermedades neurodegenerativas ha sido un área de investigación en auge en los últimos años. Un trabajo reciente nuestro y de otros ha demostrado que las neuronas corticales (CN) derivadas de células madre de pacientes con enfermedad de Alzheimer demuestran diferencias clave en la enfermedad en comparación con las CN derivadas de controles sanos. Sin embargo, la mayor parte de este trabajo se ha limitado al uso de cultivos simples de neuronas corticales o motoras derivadas de iPSC o, en algunos casos, al cocultivo de neuronas derivadas de iPSC con astrocitos humanos primarios. Hemos demostrado que el cocultivo de neuronas derivadas de iPSC con astrocitos fetales primarios facilita la maduración de las neuronas (evaluada por electrofisiología) más allá de lo que se observa solo en cultivos neuronales. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de astrocitos a partir de iPSC que permite la generación de células con expresión genética, capacidad y cinética de absorción de glutamato y secreción de factor neurotrópico consistente con los astrocitos fetales primarios. Es importante destacar que estos astrocitos iPSC pueden dirigirse a una identidad anterior versus posterior (cerebro versus médula espinal). El objetivo de este estudio es comparar la capacidad de los astrocitos derivados de iPSC con los astrocitos fetales primarios en su capacidad para facilitar la maduración de las neuronas derivadas de iPSC, con el fin de identificar las condiciones de cocultivo apropiadas donde las neuronas derivadas de iPSC alcanzan la madurez funcional. según lo evaluado por marcadores neuronales y actividad electrofisiológica. El logro de este objetivo permitiría una mayor evaluación de la contribución de las neuronas y los astrocitos a procesos patológicos específicos en la neurodegeneración y la neuroinflamación a través de la capacidad de combinar en cocultivo astrocitos y/o neuronas derivadas de iPSC enfermas versus sanas para dilucidar aún más la causa subyacente. Mecanismos que contribuyen a estos fenotipos de enfermedades. Estos estudios deberían facilitar el desarrollo de sistemas de cocultivo que impulsen el desarrollo neuronal hacia un fenotipo más maduro y mejorar la disponibilidad de sistemas modelo basados en células madre para replicar mejor los procesos fisiológicos y patológicos in vivo.

Período de información:

Los estudiantes de Year 3

El uso de la tecnología de células madre para estudiar enfermedades neurodegenerativas ha sido un área de investigación en auge en los últimos años. Un trabajo reciente nuestro y de otros ha demostrado que las neuronas corticales (CN) derivadas de células madre de pacientes con enfermedad de Alzheimer demuestran diferencias clave en la enfermedad en comparación con las CN derivadas de controles sanos. Sin embargo, la mayor parte de este trabajo se ha limitado al uso de cultivos simples de neuronas corticales o motoras derivadas de iPSC o, en algunos casos, al cocultivo de neuronas derivadas de iPSC con astrocitos humanos primarios. Hemos demostrado que el cocultivo de neuronas derivadas de iPSC con astrocitos fetales primarios facilita la maduración de las neuronas (evaluada por electrofisiología) más allá de lo que se observa solo en cultivos neuronales. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de astrocitos a partir de iPSC que permite la generación de células con expresión genética, capacidad y cinética de absorción de glutumato y secreción de factor neurotrópico consistente con los astrocitos fetales primarios. El objetivo de este estudio es comparar la capacidad de los astrocitos derivados de iPSC con la capacidad de los astrocitos fetales primarios para facilitar la maduración de las neuronas derivadas de iPSC. El logro de este objetivo permitiría una mayor evaluación de la contribución de las neuronas y los astrocitos a procesos de enfermedades específicas en la neurodegeneración y la neuroinflamación a través de la capacidad de combinar el cocultivo en enfermedades versus astrocitos y/o neuronas sanas derivadas de iPSC para dilucidar aún más la Mecanismos subyacentes que contribuyen a estos fenotipos de enfermedades. Estos estudios deberían facilitar el desarrollo de sistemas de cocultivo que impulsen el desarrollo neuronal hacia un fenotipo más maduro y mejoren la disponibilidad de sistemas modelo basados en células madre.

Detalles de la solicitud de subvención

Titulo de la aplicación:

Reprogramación celular: disección del mecanismo molecular y mejora de la eficiencia

Resumen público:

Las células madre pluripotentes tienen un potencial notable para convertirse en prácticamente cualquier tipo de célula del cuerpo, lo que las convierte en una poderosa herramienta para el estudio o tratamiento directo de enfermedades humanas. La reciente demostración de que las células madre pluripotentes inducidas (iPS) pueden derivarse de células adultas diferenciadas ofrece oportunidades sin precedentes para la investigación en biología básica, medicina regenerativa, modelado de enfermedades, descubrimiento de fármacos y toxicología. Por ejemplo, utilizando células iPS obtenidas de pacientes, se pueden modelar enfermedades in vitro y detectar fármacos de formas nunca antes posibles, lo que permite identificar nuevos candidatos terapéuticos prometedores en una fase más temprana del proceso de descubrimiento de fármacos. Además, los derivados de células iPS representan una fuente ideal para terapias de reemplazo de células autólogas, ya que no serían rechazados tras su trasplante al paciente.

Si bien está claro que las células iPS son muy prometedoras para encontrar terapias para enfermedades, existen obstáculos importantes que deben superarse antes de que se alcance todo su potencial clínico. El mecanismo de derivación de células iPS es en gran medida difícil de alcanzar y el proceso utilizado para generarlas es muy ineficiente y debe mejorarse de manera significativa. Actualmente, las células iPS se generan mediante la expresión forzada de cuatro factores moleculares utilizando virus que integran el genoma. Esto puede conducir a mutaciones y a una alteración del potencial de diferenciación de las células iPS, así como a la tumorogénesis si se trasplantan nuevamente al paciente. La naturaleza ineficiente y estocástica del proceso de reprogramación indica que pueden existir mecanismos adicionales, aún no identificados, que contribuyan a la generación de células iPS. Finalmente, aumentar la eficiencia de los protocolos actuales de derivación de células iPS aumentará la capacidad de generar grandes paneles de líneas celulares iPS específicas de cada paciente.

Proponemos utilizar un ensayo basado en células humanas para identificar moléculas pequeñas que pueden mejorar la eficiencia de la generación de células iPS. Nuestra estrategia nos permitirá identificar moléculas pequeñas que se dirigen a eventos esenciales para la derivación de células iPS, así como aquellas que reemplazan uno o más de los cuatro factores administrados por vía viral. Utilizaremos las pequeñas moléculas identificadas para descubrir vías reguladoras y objetivos moleculares implicados en la inducción de la pluripotencia, obteniendo así información valiosa sobre el mecanismo de reprogramación celular. La aplicación de estas pequeñas moléculas, así como de enfoques novedosos derivados de estudios de mecanismos de acción, ayudará a superar los problemas asociados con la integración viral y tiene el potencial de transformar terapias personalizadas de reemplazo celular, así como acelerar el descubrimiento de fármacos basados en células iPS derivadas. modelos de enfermedades.

Declaración de beneficio para California:

El sistema de atención médica de California enfrenta desafíos importantes ya que millones de niños y adultos padecen una serie de enfermedades incurables. Se espera que los costos de atención médica sigan aumentando a medida que la ciudadanía de California envejezca y requiera tratamientos para trastornos metabólicos, cardiovasculares y neurodegenerativos crónicos relacionados con la edad. Tanto el impacto económico mensurable en el sistema de atención médica de California como el incalculable sufrimiento emocional de las personas afectadas, sus familias y comunidades hacen que sea imperativo desarrollar tratamientos terapéuticos novedosos para abordar estos crecientes desafíos médicos y económicos de la sociedad. Reconociendo la utilidad potencial de las nuevas tecnologías de células madre para abordar las necesidades médicas insatisfechas de California, los votantes de California aprobaron la Proposición 71 que creó el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), una agencia que administra fondos para apoyar la investigación con células madre que tiene el mayor potencial de desarrollo. de nuevos tratamientos y curas médicos regenerativos. El programa CIRM Basic Biology Awards II tiene como objetivo financiar estudios que sentarán las bases para futuros avances clínicos y traslacionales basados en células madre. De acuerdo con esta misión, nuestro programa de investigación propuesto tiene como objetivo descubrir nuevos métodos para producir células madre pluripotentes inducidas humanas (células iPS) a escala industrial y de manera eficiente; y desarrollar una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la reprogramación celular. Como tal, nuestro programa de investigación ayudará a acelerar la realización de todo el potencial de las células iPS en terapias de medicina regenerativa basadas en células y en el descubrimiento de fármacos. Nuestro programa de investigación propuesto beneficiará al Estado de California y a sus ciudadanos de varias maneras. En primer lugar, nuestro programa de investigación sentará las bases para futuros avances clínicos y traslacionales basados en células madre para tratar y gestionar una de las necesidades médicas no cubiertas más apremiantes de California. En segundo lugar, la ejecución de nuestro programa de investigación creará nuevos empleos en los sectores académico, biotecnológico y farmacéutico en todo California. La financiación de CIRM se ampliará con financiación adicional del solicitante para aumentar el logro de los objetivos de este proyecto. La financiación del CIRM aprovechará otras fuentes de inversión en este proyecto para ayudar a garantizar el futuro continuo de California como líder mundial en innovación biomédica y medicina traslacional en beneficio de la salud humana. Por último, nuestro programa de investigación propuesto estimulará la economía de California mediante la creación de nuevas herramientas y tecnologías habilitadoras que pueden adoptarse ampliamente en toda la industria de las ciencias biológicas, promoviendo así el desarrollo en las instituciones académicas y las empresas biofarmacéuticas que crean descubrimientos y avances biomédicos. Estas actividades continuarán fortaleciendo la posición de liderazgo de California a la vanguardia de la revolución médica regenerativa y de células madre del siglo XXI.

Publicaciones

Nat Rev Drug Discov (2011): Células madre pluripotentes inducidas: oportunidades para el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. (PubMed: 22076509)

Reprogramación celular: disección del mecanismo molecular y mejora de la eficiencia

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Reprogramación celular: disección del mecanismo molecular y mejora de la eficiencia

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