Regeneración del cartílago mediante la pequeña molécula condrogénica PRO1 durante la osteoartritis

Hemos llevado a cabo un estudio de relación estructura-actividad para identificar análogos de kartogenina altamente potentes con actividades condrogénicas y condroprotectoras. Se sintetizaron más de 150 análogos con elementos estructuralmente diversos y se evaluó su actividad condrogénica (capacidad de inducir que las células madre mesenquimales se diferencien en condrocitos productores de cartílago) en células madre mesenquimales humanas y de roedores. Se identificaron varios compuestos líderes muy potentes que a continuación se evaluarán en ensayos condroprotectores, ensayos de toxicidad y selectividad basados ​​en células, ensayos farmacocinéticos y modelos de eficacia in vivo en roedores. Al mismo tiempo, se desarrollaron y utilizaron varios ensayos para evaluar los efectos protectores de los condrocitos, la retención articular y la actividad proliferativa en los condrocitos humanos del compuesto original, la kartogenina. Se descubrió que la kartogenina: (1) tiene actividad condrogénica a largo plazo en humanos y roedores; (2) posee actividad condroprotectora en condrocitos bovinos (es decir, protege contra actividades degradativas en la articulación); (3) inducir mínimamente la proliferación de condrocitos (una actividad no deseada que podría conducir a respuestas fibróticas e inmunes); (4) tener buena retención articular (compuesto retenido en el espacio intraarticular en el sitio de acción); y (5) está sujeto a una rápida eliminación sistémica (una propiedad deseable para minimizar los efectos adversos sistémicos). También identificamos el mecanismo por el cual funciona el compuesto. A diferencia de otros fármacos en desarrollo para la osteoartritis, la kartogenina no se dirige a las enzimas extracelulares implicadas en la degradación del cartílago articular. Más bien parece actuar directamente sobre una población de células madre endógenas e inducir la formación de condrocitos. La molécula se une selectivamente a una proteína intracelular filamina A, una proteína involucrada en la regulación de la red citoesquelética de la célula (elementos estructurales dentro de la célula). En lugar de modular la interacción de la filamina A con otras proteínas estructurales, la kartogenina bloquea su interacción con la proteína CBFβ (subunidad β del factor de unión central, una subunidad de un complejo de transcripción con la familia del factor de transcripción relacionado con el runt (RUNX)). El resultado es un aumento en los niveles de CBFβ en el núcleo donde se une y activa la transcripción de genes dependientes de RUNX. En particular, CBFβ activa la transcripción dependiente de RUNX1 de genes que desempeñan funciones clave en la condrogénesis. Así, esta molécula actúa mediante un mecanismo novedoso directa y selectivamente sobre la transcripción genética para inducir la diferenciación selectiva de células madre mesenquimales en condrocitos. Es importante destacar que las moléculas que actúan mediante este método deberían complementar la actividad de los fármacos en ensayos clínicos destinados a bloquear las enzimas degradativas.

Hemos logrado excelentes avances hacia la identificación de un candidato preclínico para el tratamiento de la osteoartritis. Se llevó a cabo un amplio estudio de la relación estructura-actividad con la síntesis química de más de 250 análogos del compuesto principal original. Hemos identificado moléculas con actividad mejorada en cultivos celulares y en modelos preclínicos in vivo relevantes. En base a estos esfuerzos, estamos sintetizando una serie final de moléculas que perfilaremos con respecto a la actividad de condrogénesis, farmacocinética y seguridad in vitro e in vivo. Esperamos elegir al candidato preclínico final de esta serie en el tercer año de la subvención.

La osteoartritis (OA) es la enfermedad musculoesquelética más prevalente que afecta a alrededor de 27 millones de personas en los Estados Unidos y es la principal causa de discapacidad crónica en los Estados Unidos. Las opciones terapéuticas actuales se limitan a fármacos para el dolor o modificadores de los síntomas y cirugía de reemplazo articular; No hay medicamentos modificadores de la enfermedad aprobados para uso clínico. La OA se caracteriza por una degeneración progresiva del cartílago articular, como resultado de una activación, diferenciación y muerte anormales de las células del cartílago. Existe una oportunidad terapéutica única e inexplorada para inducir a las células madre somáticas a regenerar el tejido dañado y revertir el proceso destructivo crónico. Debido a que las articulaciones limitadas se ven afectadas en la mayoría de los pacientes con OA, la inyección intraarticular (IA) de fármacos es un enfoque de tratamiento atractivo que permite una alta concentración local del fármaco con una exposición sistémica limitada. Apuntar farmacológicamente a las células madre residentes también evita los riesgos y costos asociados con los enfoques basados ​​en células. El cartílago contiene células madre mesenquimales (MSC) residentes que pueden diferenciarse in vitro para formar condrocitos. Esta observación sugiere que la inyección intraarticular de una pequeña molécula que promueve la condrogénesis in vivo preservará y regenerará el cartílago en las articulaciones afectadas por OA. Utilizando una pantalla basada en imágenes, identificamos una pequeña molécula similar a un fármaco, la kartogenina (KGN), que promueve la diferenciación eficiente y selectiva de condrocitos de las MSC in vitro. La inyección intraarticular de KGN también muestra efectos beneficiosos en modelos de lesión del cartílago aguda inducida por cirugía y crónica inducida por enzimas en roedores, así como efectos positivos en modelos de dolor por incapacitancia. Este proyecto tiene como objetivo el desarrollo de nuevos compuestos principales con actividad biológica mejorada, la demostración de la eficacia de los compuestos principales en modelos de OA en roedores y perros y el esclarecimiento de los mecanismos celulares subyacentes a las actividades de regeneración del cartílago de KGN y sus análogos. Gracias a los esfuerzos de la química medicinal, hemos diseñado y sintetizado más de 400 análogos de KGN. Utilizando ensayos basados ​​en cultivos celulares, evaluamos la actividad de diferenciación de condrocitos de estos análogos e identificamos 17 compuestos que exhiben una potencia mejorada en comparación con KGN (EC50 <100 nM). Estos compuestos no mostraron una citotoxicidad obvia en altas concentraciones (100 μM) cuando se incubaron con una variedad de células presentes en las articulaciones, incluidas MSC, condrocitos, osteoblastos y sinoviocitos. Hasta la fecha, hemos evaluado la eficacia de 7 compuestos utilizando un modelo de OA en rata (desgarro del menisco medial). Dos de los compuestos probados mostraron una reparación del cartílago significativamente mejorada al final del estudio. Al mismo tiempo, no se observaron efectos adversos, como pérdida de peso corporal, dolor o deterioro de las funciones motoras, en ninguno de los animales tratados con el compuesto. Actualmente estamos estudiando los efectos de otros 10 análogos utilizando el mismo modelo de OA, que se espera que concluya dentro de dos o tres meses. A continuación, evaluaremos la eficacia de los compuestos activos en un modelo canino de OA (meniscectomía parcial con beagles). Además, se realizarán estudios completos de farmacocinética en roedores y toxicología sin BPL para los compuestos principales. Para estudiar los mecanismos subyacentes de la condrogénesis inducida por KGN, diseñamos y sintetizamos una sonda de afinidad con actividades biológicas comparables a la de KGN. Mediante métodos basados ​​en afinidad, identificamos la proteína filamina A (FLNA) como el objetivo de KGN. En las MSC, KGN se une a FLNA e interrumpe su interacción con el factor de unión central β (CBFβ), lo que conduce a la translocalización nuclear de CBFβ, la posterior activación del programa de transcripción RUNX1-CBFβ y, como resultado, la diferenciación de condrocitos. Este mecanismo se ha confirmado utilizando métodos biológicos celulares que incluyen el silenciamiento de genes mediado por ARNi y la sobreexpresión de ADNc de genes relevantes como FLNA, CBFβ y RUNX1. Estos estudios han sido publicados en la revista Science.

Hemos demostrado eficacia en modelos preclínicos in vivo de un posible fármaco candidato para el tratamiento de la osteoartritis. La pequeña molécula funciona diferenciando selectivamente las células madre mesenquimales en condrocitos para reparar el cartílago dañado.