Relevancia biológica de los microARN en la diferenciación de hESC en el páncreas endocrino

El objetivo a largo plazo de nuestra investigación es comprender los procesos bioquímicos que regulan la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (hESC) en células progenitoras pancreáticas y, en última instancia, en células β (beta) productoras de insulina y sensibles a la glucosa. El trasplante de islotes con supresión inmune persistente se ha mostrado prometedor para curar la diabetes tipo 1 (TID). Sin embargo, un obstáculo importante para la implementación a gran escala de este enfoque es la escasez de islotes injertables. Las hESC, que pueden someterse a una autorrenovación ilimitada y diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo, tienen el potencial de convertirse en una fuente ilimitada de células β pancreáticas; sin embargo, desafíos importantes han obstaculizado el desarrollo clínico de esta prometedora terapia basada en hESC. La investigación en curso en nuestro laboratorio está dirigida a derivar células β a partir de hESC. De los diversos factores genéticos que contribuyen a la diferenciación de las células madre, los miARN (microARN) están emergiendo como determinantes importantes. Los miARN son ARN reguladores no codificantes que se expresan dinámicamente durante la diferenciación de hESC. Mapear la expresión del desarrollo de los miARN durante la transición de la pluripotencia a los progenitores pancreáticos ayudará a aclarar los mecanismos subyacentes a la especificación del linaje y, en última instancia, mejorará los protocolos de diferenciación. Específicamente, los objetivos de esta subvención CIRM son dilucidar el papel que desempeñan los miARN en el desarrollo de hESC en células de linaje endocrino y proporcionar detalles cruciales sobre la arquitectura molecular de las poblaciones de precursores endocrinos, la especificación del linaje y la maduración de las células β. La hipótesis central que impulsa la investigación es que los miARN son reguladores esenciales del desarrollo de las células endocrinas. Estamos trabajando bajo el postulado de que los miARN son objetivos lógicos para la experimentación in vitro debido a su papel en la mediación del desarrollo de las células pancreáticas. Nuestros objetivos son los siguientes: Objetivo 1: generar perfiles de expresión de miR utilizando secuenciación profunda para etapas definidas de desarrollo desde células pluripotentes hasta endocrinas y seleccionar miR candidatos para manipulaciones que impliquen silenciamiento y sobreexpresión. Objetivo 2: identificar objetivos de miR mediante secuenciación profunda de complejos silenciadores inducidos por ARN (RISC) en poblaciones celulares definidas y evaluación de sus funciones en la diferenciación in vitro y después de un trasplante experimental. Durante el actual período de financiación, se han logrado avances en los dos objetivos específicos propuestos originalmente. De este trabajo se han publicado un manuscrito y un artículo de revisión y se han presentado/en revisión otros dos artículos de investigación. Estudios publicados. A) "El eje SDF-1α/CXCR4 es necesario para la proliferación y maduración de células progenitoras endocrinas pancreáticas fetales humanas". fue publicado en PLoSONE. B) “De la pluripotencia a los islotes: los miARN como reguladores críticos de la diferenciación celular humana” se publicó en Advances in Genetics. Estudios presentados. A) “El análisis de sRNA-seq de células madre embrionarias humanas y endodermo definitivo revela microARN expresados ​​diferencialmente y nuevos isomiR con objetivos distintos” está en revisión en Stem Cells. B) “La señalización de Jak/Stat y MAP quinasa regula la pluripotencia de las células madre embrionarias humanas” se volverá a presentar a Cell Stem Cell a principios de octubre. Trabajo en progreso. A) Secuenciación profunda de miARN de una población purificada de células PDX-1+ derivadas de hESC. Para lograr nuestro objetivo de comprender el papel que desempeñan los miARN en el impulso de la diferenciación de las células productoras de insulina a partir de hESC pluripotentes, hemos secuenciado miARN de una población heterogénea de hESC que se han dirigido hacia el linaje endocrino. B) Secuenciación profunda de miARN a intervalos de 24 horas durante la diferenciación de hESC hacia precursores pancreáticos. Una tarea importante durante el primer año de financiación es secuenciar los cambios en la expresión de miARN en intervalos seleccionados durante el proceso de diferenciación. Esta información es fundamental para que podamos desarrollar algoritmos para determinar cómo los miARN impulsan la diferenciación y para la identificación de objetivos de miARN/ARNm. C) Desarrollo de algoritmos para analizar el cambio en la expresión de miR en sistemas complejos. Durante las primeras fases del proyecto CIRM, Natural Selection Inc. se centró en algoritmos para analizar el cambio en la expresión de microARN en múltiples conjuntos de datos. D) Generación de una población de células PDX1+ mediante tecnología de nucleasa de dedos de zinc. Un objetivo fundamental de los estudios propuestos es generar una población purificada de células precursoras endocrinas. Aunque surgieron algunos problemas técnicos con la construcción del vector, creemos que hemos superado los obstáculos principales y tendremos estas células para el análisis de microARN durante el próximo período de financiación. En conjunto, la información generada en este estudio nos ayuda a comprender, describir y, en última instancia, optimizar mejor la diferenciación de hESC. Creemos que los resultados de este proyecto tienen el potencial de crear un cambio de paradigma en la comprensión de la ontogenia celular del páncreas y ayudar a identificar qué tipos de células se pueden utilizar para la terapia de trasplante en la diabetes tipo 1.

El objetivo a largo plazo de nuestra investigación es comprender los procesos bioquímicos que regulan la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (hESC) en células progenitoras pancreáticas y, en última instancia, en células β (beta) productoras de insulina y sensibles a la glucosa. Las hESC, que pueden someterse a una autorrenovación ilimitada y diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo, tienen el potencial de convertirse en una fuente ilimitada de células β pancreáticas; sin embargo, desafíos importantes han obstaculizado el desarrollo clínico de esta prometedora terapia basada en hESC. La investigación en curso en nuestro laboratorio está dirigida a derivar células β a partir de hESC. De los diversos factores genéticos que contribuyen a la diferenciación de las células madre, los miARN (microARN) están emergiendo como determinantes importantes. Los miARN son ARN reguladores no codificantes que se expresan dinámicamente durante la diferenciación de hESC. Mapear la expresión del desarrollo de los miARN durante la transición de la pluripotencia a los progenitores pancreáticos ayudará a aclarar los mecanismos subyacentes a la especificación del linaje y, en última instancia, mejorará los protocolos de diferenciación. Específicamente, los objetivos de esta subvención CIRM son dilucidar el papel que desempeñan los miARN en el desarrollo de hESC en células de linaje endocrino y proporcionar detalles cruciales sobre la arquitectura molecular de las poblaciones de precursores endocrinos, la especificación del linaje y la maduración de las células β. La hipótesis central que impulsa la investigación es que los miARN son reguladores esenciales del desarrollo de las células endocrinas. Estamos trabajando bajo el postulado de que los miARN son objetivos lógicos para la experimentación in vitro debido a su papel en la mediación del desarrollo de las células pancreáticas. Nuestros objetivos son los siguientes: Objetivo 1: generar perfiles de expresión de miR utilizando secuenciación profunda para etapas definidas de desarrollo desde células pluripotentes hasta endocrinas y seleccionar miR candidatos para manipulaciones que impliquen silenciamiento y sobreexpresión. Objetivo 2: identificar objetivos de miR mediante secuenciación profunda de complejos silenciadores inducidos por ARN (RISC) en poblaciones celulares definidas y evaluación de sus funciones en la diferenciación in vitro y después de un trasplante experimental. Durante el actual período de financiación, se han logrado avances en los dos objetivos específicos propuestos originalmente. Estudios publicados. "A) "Imágenes del páncreas fetal humano". fue publicado en el Journal of Visualized Experiments. Patentes provisionales presentadas. A) “Nuevas combinaciones de reguladores de genes transcripcionales”. B) “Ensayo para detectar onco-miRs circulantes en suero o células” Trabajo en curso. A) Expresión de microARN emparejado y desarrollo de un sistema informador para el destino del linaje. Hemos creado una línea celular que reporta la expresión de PDX1, un marcador tanto de precursores pancreáticos como de células beta maduras, con el fin de seleccionar y purificar las células diana en diferenciación tardía. Nuestro laboratorio describió previamente miR-375 como el miARN más abundante en el endodermo definitivo (DE). Otros laboratorios han demostrado que miR-375 también se expresa en el páncreas durante el desarrollo, y específicamente en las células beta de los islotes maduros, donde regula la secreción de insulina. Por el contrario, miR-122 es el miARN más expresado en el hígado y surge en la región del endodermo más cercana a las yemas pancreáticas. En nuestro protocolo de diferenciación de hESC, solo miR-375 se expresa en la etapa DE, que normalmente tiene una pureza de aproximadamente el 98 %. miR-122 no se expresa en DE, pero aumenta en niveles para coincidir con una menor expresión de miR-375 a medida que se forma una mezcla más heterogénea de células a medida que DE se diferencia en múltiples linajes. Hemos generado líneas celulares informadoras que pueden distinguir las células pancreáticas de las células hepáticas en la diferenciación posterior a la DE, y posiblemente las células beta maduras de otras células endocrinas. B) Secuenciación profunda de poblaciones de hESC purificadas de puntos de tiempo seleccionados durante la diferenciación de hESC y desarrollo de algoritmos para analizar el cambio en la expresión de miARN en sistemas complejos. En nuestro enfoque anterior, aplicamos filtros de patrones a los datos para ver qué miR coincidían con un filtro en particular. Esto fue valioso ya que nos ayudó a determinar qué miR tenían patrones de expresión similares. Sin embargo, todavía había mucha variación. Por lo tanto, realizamos el análisis utilizando nuevos métodos de agrupación desarrollados en conjunto con NSI. El último enfoque nos ha brindado información muy valiosa sobre los datos. Hemos descubierto que existen reguladores maestros de miR y/o están siendo regulados por otro regulador, pero ese regulador los está sesgando a lo largo de una gran escala de tiempo (semanas). Las fluctuaciones diarias en las que se centran la mayoría de los investigadores no se encuentran en este último grupo, lo que sugiere que la regulación miR a corto y largo plazo está regulada de manera diferencial. En conjunto, la información generada en este estudio nos ayuda a comprender, describir y, en última instancia, optimizar mejor la diferenciación de hESC. Creemos que los resultados de este proyecto tienen el potencial de crear un cambio de paradigma en la comprensión de la ontogenia celular del páncreas y ayudar a identificar qué tipos de células se pueden utilizar para la terapia de trasplante en la diabetes tipo 1.

El objetivo a largo plazo de nuestra investigación es comprender los procesos bioquímicos que regulan la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (hESC) en células progenitoras pancreáticas y, en última instancia, en células β (beta) productoras de insulina y sensibles a la glucosa. El trasplante de islotes con supresión inmune persistente se ha mostrado prometedor para curar la diabetes tipo 1 (TID). Sin embargo, un obstáculo importante para la implementación a gran escala de este enfoque es la escasez de islotes injertables. Las hESC, que pueden someterse a una autorrenovación ilimitada y diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo, tienen el potencial de convertirse en una fuente ilimitada de células β pancreáticas; sin embargo, desafíos importantes han obstaculizado el desarrollo clínico de esta prometedora terapia basada en hESC. La investigación en curso en nuestro laboratorio está dirigida a derivar células β a partir de hESC. De los diversos factores genéticos que contribuyen a la diferenciación de las células madre, los miARN (microARN) están emergiendo como determinantes importantes. Los miARN son ARN reguladores no codificantes que se expresan dinámicamente durante la diferenciación de hESC. Mapear la expresión del desarrollo de los miARN durante la transición de la pluripotencia a los progenitores pancreáticos ayudará a aclarar los mecanismos subyacentes a la especificación del linaje y, en última instancia, mejorará los protocolos de diferenciación. Específicamente, los objetivos de esta subvención CIRM son dilucidar el papel que desempeñan los miARN en el desarrollo de hESC en células de linaje endocrino y proporcionar detalles cruciales sobre la arquitectura molecular de las poblaciones de precursores endocrinos, la especificación del linaje y la maduración de las células β. La hipótesis central que impulsa la investigación es que los miARN son reguladores esenciales del desarrollo de las células endocrinas. Estamos trabajando bajo el postulado de que los miARN son objetivos lógicos para la experimentación in vitro debido a su papel en la mediación del desarrollo de las células pancreáticas. Nuestros objetivos son los siguientes: Objetivo 1: generar perfiles de expresión de miR utilizando secuenciación profunda para etapas definidas de desarrollo desde células pluripotentes hasta endocrinas y seleccionar miR candidatos para manipulaciones que impliquen silenciamiento y sobreexpresión. Objetivo 2: identificar objetivos de miR mediante secuenciación profunda de complejos silenciadores inducidos por ARN (RISC) en poblaciones celulares definidas y evaluación de sus funciones en la diferenciación in vitro y después de un trasplante experimental. Estudios publicados. A) “El análisis de sRNA-seq de células madre embrionarias humanas y endodermo definitivo revela microARN expresados ​​diferencialmente y nuevos isomiR con objetivos distintos” Estudios enviados. Recientemente, enviamos un manuscrito titulado "Dinámica de microARN durante la diferenciación de células madre embrionarias humanas al endodermo pancreático" a Células madre y desarrollo. Este trabajo es un estudio integral de microARN que detalla nuestros experimentos de secuenciación profunda. En el estudio, describimos los cambios en la expresión de microARN que ocurren durante los primeros 10 días de la formación de progenitores pancreáticos, confirmamos la expresión de miARN seleccionados en varios puntos temporales, correlacionamos la expresión con objetivos de ARNm conocidos e integramos la expresión de proteínas con datos de nuestra LC/cuantitativa. Experimentos de EM. Este trabajo proporciona una mirada poco común, simultánea y completa a las hESC a nivel de microARN, ARNm y proteína. Trabajo en progreso. A) Regulación transcripcional por Ago2 y miRNAs. MicroARN y diferenciación de hESC. Los microARN (miR) regulan las redes de genes postranscripcionales y funcionan de manera análoga a los factores de transcripción. Los miARN maduros son parcialmente complementarios a uno o más ARN mensajeros (ARNm) y funcionan principalmente para regular negativamente la expresión genética. La importancia de la actividad de miARN en hESC durante el desarrollo de los mamíferos se ha establecido mediante la eliminación de genes necesarios para la biogénesis global de miARN. Nuestro trabajo reciente ha descubierto que la expresión de miARN en hESC es dinámica, lo que indica que los miARN impulsan la diferenciación. Hemos estado trabajando bajo la hipótesis de que la transcripción de loci de miARN está impulsada por miARN maduro y Ago2, y al manipular Ago2, podemos afectar los niveles de expresión de miARN precursor y maduro y, en última instancia, regular la diferenciación de hESC. B) La expresión de la isoenzima PKCβ está regulada por miR-653 durante la formación definitiva del endodermo. Recientemente, hemos empleado secuenciación profunda para generar mapas temporales de cambios en la expresión de microARN durante los primeros diez días de diferenciación de hESC hacia el desarrollo de células endocrinas. Los resultados de los estudios de expresión de miARN/ARNm identificaron la isozima beta de PKC como un objetivo potencial de miR-653. Descubrimos que miR-653 está específicamente asociado con el destino DE y contiene un fuerte sitio de unión de consenso en la UTR 3 'de PKCβ. En las líneas hESC Cyt49 y H9, el valor log2 para la expresión de ARNm de PKCβ disminuyó drásticamente durante la formación de DE. Esto era exclusivo de la isoforma beta PKC. El análisis Western blot de la expresión endógena de PKCβII confirmó una pérdida a nivel de proteína a medida que las células dejaron la pluripotencia para DE.