Herramientas de anticuerpos para agotar o aislar células madre teratogénicas, cardíacas y sanguíneas de hESC

Nuestro programa se centra en mejorar los métodos que pueden usarse para purificar células madre para que puedan usarse de manera segura y efectiva para terapia. Una limitación significativa a la hora de trasladar los descubrimientos de laboratorio a la práctica clínica sigue siendo nuestra incapacidad para separar células madre específicas que generan un tipo de tejido deseado de una mezcla de células madre "pluripotentes", que generan varios tipos de tejido. Un trasplante ideal entonces consistiría únicamente en células madre de tejido específico que conservaran un fuerte potencial regenerativo. Las células pluripotentes, por otro lado, presentan el riesgo, cuando se trasplantan, de generar tejido normal en el lugar equivocado, tejido anormal o cáncer. Por lo tanto, hemos concentrado nuestros esfuerzos en idear estrategias para hacer que las células pluripotentes se conviertan en células madre específicas de tejido deseadas o para separar estas células deseadas de una mezcla de muchos tipos de células. Nuestro enfoque para separar células madre de tejidos específicos de cultivos mixtos se basa en la teoría de que cada tipo de célula tiene un conjunto muy específico de moléculas en su superficie que pueden actuar como una firma. Una vez conocida esta firma, se pueden utilizar anticuerpos (moléculas que se unen específicamente a estos marcadores de superficie) para marcar todas las células de un tipo deseado y eliminarlas de una población mixta. Para mejorar la terapia con células madre, nuestro objetivo es identificar los marcadores distintivos en: (1) las células madre que son pluripotentes o que tienen especial probabilidad de generar tumores; y (2) las células madre específicas de tejido. Al desarrollar luego anticuerpos contra las células pluripotentes o que causan tumores, podemos excluirlas de un grupo de células que se trasplantarán. Al desarrollar anticuerpos contra las células madre específicas de tejido, podemos eliminarlas de una mezcla para seleccionarlas para el trasplante. Para el segundo enfoque, estamos particularmente interesados ​​en atacar las células madre que se convierten en tejido cardíaco y las células que se desarrollan en células sanguíneas maduras. A medida que desarrollamos formas de aislar las células deseadas, las probamos trasplantándolas a animales y observando cómo crecen. Así, el primer objetivo de nuestro programa es desarrollar herramientas para aislar células madre pluripotentes, especialmente aquellas que pueden generar tumores en receptores de trasplantes. Para ello, probamos un anticuerpo dirigido a un marcador de células pluripotentes (antígeno embrionario específico de etapa 5 [SSEA-5]) que habíamos identificado previamente. Trasplantamos a animales una población de células madre a las que se les extirparon las células que expresan SSEA-5 o no. Los animales que recibieron los trasplantes que carecían de células que expresan SSEA-5 desarrollaron menos teratomas (tumores que consisten en una mezcla anormal de muchos tejidos) y más pequeños. Abordando el problema desde otro ángulo, analizamos teratomas en animales que habían recibido trasplantes de células madre. Encontramos SSEA-5 en un pequeño grupo de células que creemos que son responsables de generar todo el tumor. El segundo objetivo del programa es desarrollar métodos para cultivar selectivamente células madre cardíacas o aislarlas de cultivos mixtos. Así, en el último año probamos procedimientos para cultivar células madre pluripotentes en condiciones que hagan que se conviertan en células madre cardíacas. También probamos una combinación de cuatro marcadores que, según nuestra hipótesis, etiquetarían las células madre cardíacas para su separación. Cuando estas células crecieron en las condiciones adecuadas, comenzaron a "latir" y tenían una actividad eléctrica similar a la observada en las células cardíacas normales. Cuando trasplantamos las células con los cuatro marcadores a ratones con corazones normales o dañados, parecieron desarrollarse hasta convertirse en células cardíacas maduras. Sin embargo, estas células (humanas) no se integraron con las células cardíacas nativas (de ratón), quizás debido a la diferencia de especies. Así que variamos el enfoque y trasplantamos células madre del corazón humano en tejido cardíaco humano que había sido previamente implantado en ratones. En este caso, encontramos alguna evidencia de que las células trasplantadas se diferenciaron en células cardíacas maduras y se integraron con las células humanas circundantes. El tercer objetivo de nuestro proyecto es cultivar células madre que den lugar únicamente a células sanguíneas y probarlas para su trasplante. El año pasado, desarrollamos un nuevo procedimiento para tratar cultivos de células madre pluripotentes para que se diferencien en células madre específicas que generen células sanguíneas y vasos sanguíneos. Ahora estamos trabajando para perfeccionar nuestra comprensión y nuestros métodos para terminar con un cultivo de células madre diferenciadas que genere solo células sanguíneas y no vasos. En resumen, hemos descubierto marcadores y probado combinaciones de anticuerpos para estos marcadores que pueden seleccionar células no deseadas para su eliminación o células deseadas para su inclusión en trasplantes de células madre. También hemos comenzado a desarrollar técnicas para tomar un grupo de células madre que pueden generar muchos tipos de tejidos y cultivarlas en condiciones que hagan que se conviertan en células madre específicas de cada tejido que puedan usarse de forma segura para trasplantes.

Nuestro programa se centra en mejorar los métodos para purificar las células madre productoras de sangre y de corazón para que puedan usarse de forma segura y eficaz para la terapia. Los métodos actuales para identificar y aislar células madre productoras de sangre a partir de la médula ósea y la sangre son eficaces. Además, descubrimos que si se trasplantan células madre productoras de sangre, crean en el receptor un sistema inmunológico que tolerará (es decir, no rechazará) órganos, tejidos u otros tipos de células madre tisulares (p. ej. piel, cerebro o corazón) del mismo donante. Muchos donantes vivos o recientemente fallecidos a menudo no pueden aportar estas células madre, por lo que necesitaremos, en el futuro, una única fuente biológica de cada uno de los diferentes tipos de células madre (por ejemplo, sanguíneas y cardíacas) para cambiar todo el campo de la medicina regenerativa. La razón fundamental para financiar la investigación con células madre embrionarias y otras células madre pluripotentes es crear bancos seguros de células pluripotentes predefinidas. Luego se podrían utilizar protocolos para diferenciar estas células en células madre productoras de sangre apropiadas para inducir tolerancia a otras células madre tisulares de la misma línea de células madre embrionarias. Sin embargo, los protocolos existentes para la diferenciación de células madre a menudo conducen a células pluripotentes (células que generan múltiples tipos de tejido), que presentan un riesgo de generar tejido normal en la ubicación incorrecta, tejido anormal o cánceres llamados teratomas. Para abordar estos problemas, hemos concentrado nuestros esfuerzos en idear estrategias para (a) hacer que las células pluripotentes se conviertan en células madre específicas de tejido deseadas, y (b) separar estas células deseadas de todas las demás células, incluidas las células que causan teratoma. En el primer período de financiación de esta subvención, logramos generar anticuerpos que identifican y eliminan las células que causan teratoma. El año pasado, identificamos marcadores de superficie de células que solo pueden dar origen al tejido cardíaco. Primero estudiamos los genes que se activaban en estas células, confirmando además que probablemente darían lugar al tejido cardíaco. Utilizando anticuerpos contra estos marcadores de superficie, purificamos células madre del corazón a una concentración más alta que la alcanzada por otros métodos de purificación. Hemos demostrado que estas células madre cardíacas se pueden trasplantar de manera que se integren en el corazón humano, pero no en el de ratón, y participen en latidos fuertes y sincronizados correctamente. En el embrión, un grupo de células madre tempranas en el corazón en desarrollo dan origen a (a) células cardíacas; (b) células que recubren las paredes internas de los vasos sanguíneos; y (c) células musculares que rodean los vasos sanguíneos. Identificamos marcadores de superficie celular que podrían usarse para separar cada uno de estos subconjuntos entre sí y de sus células madre comunes. Finalmente, determinamos que una sustancia química específica del cuerpo, el factor de crecimiento de fibroblastos, aumentaba el crecimiento de un grupo de células madre pluripotentes que dan lugar a células madre más específicas que producen células sanguíneas o el revestimiento de los vasos sanguíneos. Esta sustancia química también impidió que las células madre productoras de sangre se convirtieran en células sanguíneas específicas. En las primeras etapas del embrión, las células pluripotentes se separan en tres categorías distintas llamadas "capas germinales": el endodermo, el mesodermo y el ectodermo. Cada una de estas capas germinales da lugar posteriormente a determinados órganos. Nuestros estudios de los precursores del mesodermo (la capa que genera el corazón, los vasos sanguíneos, la sangre, etc.) nos llevaron por exclusión a desarrollar técnicas para dirigir la diferenciación de las células ES hacia el endodermo (la capa que da origen al hígado, páncreas, revestimiento intestinal). , etc.). Un estudiante de posgrado realizó la mayor parte de este trabajo antes de unirse a nuestro esfuerzo para encontrar formas de producir células madre formadoras de sangre funcionales a partir de células ES. Había identificado un grupo de proteínas que podríamos utilizar para dirigir secuencialmente las células madre embrionarias para que se desarrollaran casi exclusivamente en endodermo, luego en subconjuntos de células del tracto digestivo y, finalmente, en células madre hepáticas. Estas células madre hepáticas derivadas de células madre embrionarias se integraron en hígados de ratón y mostraron signos de función normal del tejido hepático (p. ej., secreción de albúmina, una proteína importante en la sangre). Utilizando las directrices de los protocolos que generaron estas células madre hepáticas, ahora hemos vuelto a centrar nuestra atención en nuestro objetivo de generar a partir del mesodermo los predecesores de las células madre formadoras de sangre y, en última instancia, las células madre formadoras de sangre. En resumen, hemos seguido descubriendo señales que hacen que las células madre pluripotentes (que pueden generar muchos tipos de tejido) se conviertan en células madre específicas de tejido que se desarrollan exclusivamente en el corazón, las células sanguíneas, las células que recubren los vasos sanguíneos y las células que recubren ciertas secciones. del tracto digestivo o células del hígado. Este trabajo también ha implicado determinar las moléculas distintivas en la superficie de varias células que permiten aislarlas y casi purificarlas. Estos resultados nos acercan a poder purificar un tipo de célula madre deseada para ser trasplantada de forma segura para generar un único tipo de tejido.

El objetivo principal de nuestro programa es mejorar los métodos para generar poblaciones puras de células madre específicas de tejido que formen solo tejido cardíaco o sangre. Estas células madre específicas de tejido son necesarias para desarrollar terapias seguras y eficaces. Si se inyectan en pacientes con daño cardíaco, las células madre formadoras de corazón podrían usarse para regenerar tejido cardíaco sano. Las células madre productoras de sangre son capaces de regenerar el sistema hematopoyético después de la terapia contra el cáncer y reemplazar un sistema hematopoyético defectuoso. Demostramos que las células madre productoras de sangre de un donante determinado inducen en el receptor una tolerancia permanente al trasplante de todos los órganos, tejidos u otras células madre tisulares del mismo donante. Por lo tanto, tener una única fuente biológica de cada uno de los diferentes tipos de células madre (por ejemplo, sanguíneas y cardíacas) revolucionaría la medicina regenerativa. Nuestros proyectos implican la generación de células madre específicas de tejido a partir de células madre pluripotentes (PSC), estas últimas son células madre que pueden formar todos los tejidos del cuerpo. Las PSC (que incluyen células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas) pueden convertirse en todo tipo de células más especializadas en un proceso conocido como "diferenciación". Debido a que las PSC pueden cultivarse en cantidades muy grandes, diferenciarlas en células madre específicas de tejido podría conducir a bancos de células madre de tejido definidas para trasplante a pacientes: la razón principal para realizar investigaciones sobre PSC. Sin embargo, los métodos actuales para diferenciar las PSC a menudo generan mezclas de varios tipos de células que no son seguras para inyectarse en los pacientes. Por lo tanto, generar una población pura de un tipo de célula deseado a partir de PSC es fundamental para la medicina regenerativa; la pureza es una preocupación clave para la terapia celular, al igual que lo es para los medicamentos. Hemos inventado tecnologías para purificar los tipos deseados de células a partir de poblaciones celulares complejas, lo que nos permite aislar con precisión una población pura de células madre específicas de tejido a partir de PSC diferenciadoras para terapia celular. Por ejemplo, en nuestro trabajo sobre las células formadoras de corazón, desarrollamos etiquetas para las células que progresivamente dan lugar a células cardíacas. Utilizamos estas células marcadas para aclarar el proceso de diferenciación natural y gradual que conduce de las PSC a las células madre formadoras del corazón y, finalmente, a diferentes células dentro del corazón. Al explotar estas tecnologías para aislar los tipos de células deseados, hemos completado el primer paso para convertir las PSC humanas en células madre formadoras de corazón. En el laboratorio, cuando trasplantamos estas células madre formadoras de corazón a un corazón humano, se integraron con el tejido circundante y participaron en latidos sincronizados correctamente. En el futuro esperamos introducir células madre formadoras de corazón en el corazón dañado para regenerar tejido sano. También hemos intentado convertir las PSC en células madre productoras de sangre mediante la comprensión del complejo proceso de formación de la sangre en el embrión temprano. Como se mencionó anteriormente, si se trasplantan células madre productoras de sangre a pacientes, crean en el receptor un sistema inmunológico que tolerará (es decir, no rechazará) otros tejidos y tipos de células madre tisulares (por ejemplo, para la piel o el corazón) del paciente. mismo donante. Por lo tanto, convertir las PSC en células madre productoras de sangre proporcionará la base para toda la medicina regenerativa, mediante la cual las células madre productoras de sangre y las otras células madre tisulares necesarias pueden generarse a partir de la misma línea celular pluripotente y trasplantarse juntas. En estudios paralelos a los anteriores, hemos convertido las PSC en células madre formadoras de hígado. En el embrión, el hígado surge de un tipo de célula conocido como endodermo, mientras que la sangre y el corazón emergen de un tipo de célula diferente conocido como mesodermo. Aprendimos que las PSC solo podían dirigirse para formar endodermo (y posteriormente hígado) desviándolas del camino que conduce al mesodermo. A través de este enfoque, podríamos convertir las PSC humanas en células endodérmicas (con una pureza >99 %) y luego en células madre formadoras de hígado que, cuando se inyectaban en el hígado de un ratón, daban lugar a células hepáticas humanas. Esto podría tener importancia terapéutica para pacientes humanos con daño hepático. Finalmente, hemos desarrollado métodos para agotar las PSC de mezclas de células diferenciadas de las PSC, porque las PSC residuales en estas mezclas pueden formar tumores (conocidos como teratomas). Estos métodos deberían aumentar la seguridad de la terapia con células madre tisulares derivadas de PSC. En resumen, hemos desarrollado métodos para convertir las PSC en células madre específicas de tejido que se desarrollan exclusivamente en células del corazón, la sangre o el hígado. Este trabajo ha implicado determinar las moléculas distintivas en la superficie de varias células que permiten aislarlas y casi purificarlas. Estos resultados nos acercan a poder purificar un tipo de célula madre deseada para ser trasplantada de forma segura para generar un único tipo de tejido.