Uso de citometría de flujo para comparar la dinámica de la fagocitosis del segmento externo de fotorreceptores en células del EPR derivadas de iPS.
Año de publicación:
2012
Identificación de PubMed:
22871841
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
La luz que ingresa al ojo activa las neuronas fotorreceptoras que convierten el estímulo en impulsos eléctricos. Estos impulsos regresan a través del ojo al cerebro, donde forman la base de la visión. Los fotorreceptores de bastones y conos dependen en gran medida de otros tipos de células de la retina para funcionar correctamente. Las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son especialmente importantes; estos protegen a los fotorreceptores de la toxicidad inducida por la luz al consumir las puntas de las células fotorreceptoras que habitualmente se dañan por la exposición intensa a la luz. Las células del EPR realizan esta tarea esencial (llamada fagocitosis) a diario. Si las células del EPR mueren o se vuelven disfuncionales, es decir, al no realizar una fagocitosis eficaz, los fotorreceptores invariablemente morirán. Este fenómeno ocurre en enfermedades humanas, incluida la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de pérdida de visión en los ancianos. Una terapia potencial prometedora es implantar EPR generado a partir de células madre en la parte posterior del ojo para reemplazar las células enfermas del paciente. Varios grupos, incluido el nuestro, han demostrado que esta terapia funciona muy bien en ratas con degeneración retiniana espontánea, pero quedan varias cuestiones técnicas sobre qué tan bien funcionan las células implantadas en comparación con las células reales del EPR. Dado que la fagocitosis es una función tan crítica, desarrollamos una forma única de probar qué tan bien las células del EPR pueden fagocitar las puntas de las células fotorreceptoras antes de la implantación. Utilizamos un método llamado citometría de flujo que se utiliza para medir la fluorescencia en células individuales. Las células del EPR pueden volverse fluorescentes si se les "alimentan" segmentos externos de fotorreceptores que se tratan con biomarcadores fluorescentes verdes. Esperamos varias horas después de alimentar las células y luego medimos la cantidad de fluorescencia verde que emitían. En este estudio pudimos demostrar que las células del EPR que generamos a partir de células madre fagocitaron cronológicamente un número igual de segmentos externos de fotorreceptores, así como lo hacen las células del EPR humanas reales. También demostramos mediante citometría de flujo que el EPR derivado de células madre generaba la maquinaria celular correcta necesaria para una fagocitosis eficiente. Por lo tanto, sugerimos que esta técnica se emplee en el campo para determinar si las células del EPR derivadas de células madre están listas para el trasplante. Los resultados de este estudio se suman a la creciente evidencia de que las células madre derivadas del EPR funcionan tan bien como las células reales del EPR, y son opciones terapéuticas realistas para el tratamiento de la DMAE.
Resumen científico:
Propósito: Los injertos autólogos de epitelio pigmentario de la retina (EPR) pueden derivarse fácilmente de células iPS (iPS-EPR). Es fundamental caracterizar rigurosamente los iPS-RPE utilizando métodos estandarizados y cuantificables para tener la confianza de que son sustitutos seguros y adecuados del RPE enfermo antes de utilizarlos en entornos clínicos. Una función importante y requerida es que el iPS-RPE fagocite los segmentos externos del fotorreceptor (POS). Métodos: Desarrollamos un ensayo basado en citometría de flujo para monitorear la unión y la internalización de POS marcado con FITC por ARPE-19, RPE fetal humano (hfRPE) y dos tipos de iPS-RPE. Se comparó la expresión y densidad de los receptores de integrina alfavbeta5, CD36 y MerTK, que son necesarios para la fagocitosis. Resultados: La tripsinización de las células del EPR tratadas da como resultado la liberación de POS unido. El número de POS liberado, el porcentaje de células que internalizaron POS, el brillo de la señal FITC de las células y la densidad de la superficie de los receptores de fagocitosis en células individuales del EPR se midieron mediante citometría de flujo. Estos ensayos revelan que la densidad del receptor es dinámica durante la diferenciación y esto puede afectar la dinámica de unión e internalización de las células del EPR. El iPS-RPE altamente diferenciado fagocita POS de manera más eficiente que el hfRPE. Conclusiones: Se debe tener precaución de no utilizar injertos de EPR hasta demostrar que son completamente funcionales. La densidad de los receptores de fagocitosis es dinámica y puede usarse como un predictor de qué tan bien funcionarán las células iPS-RPE in vivo. La dinámica de fagocitosis observada entre iPS-RPE y RPE primario es muy alentadora y se suma a la creciente evidencia de que iPS-RPE puede ser un reemplazo viable para RPE disfuncional o moribundo en pacientes humanos.