Transducción de células humanas con lentivirus ecotrópicos complejados con polímeros para mejorar la bioseguridad.

Los estudios de biología de células madre y tumorales a menudo requieren la transducción viral de células humanas con oncogenes conocidos o sospechosos, lo que plantea importantes problemas de seguridad para el personal de laboratorio. Los lentivirus pantrópicos, como el pseudotipo VSV-G comúnmente utilizado, son una herramienta valiosa para estudiar la función genética porque pueden transducir muchos tipos de células, incluidas las células que no se dividen. Sin embargo, es posible que los investigadores deseen evitar la producción y centrifugación de virus pantrópicos que codifican oncogenes debido a requisitos de manipulación de mayor nivel de bioseguridad y problemas de seguridad. Se sabe que varios oncogenes potentes, incluidos c-Myc y el antígeno T grande SV40, mejoran la producción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Todos los demás cambios genéticos conocidos que inducen iPSC (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 y pérdida de función de p53) también tienen vínculos con el cáncer, lo que los convierte también en un problema de seguridad relativamente alto. Si bien estos virus relacionados con el cáncer son útiles para estudiar la reprogramación y la pluripotencia celular, deben usarse de manera segura. Para abordar estos problemas de bioseguridad, demostramos un método para la transducción de células humanas con lentivirus ecotrópicos, con énfasis adicional en costos reducidos y manejo conveniente. Hemos producido lentivirus ecotrópicos con un título suficientemente alto para transducir más del 90 % de las células humanas que expresan receptores expuestas al virus, lo que valida la eficacia de este enfoque. Los lentivirus suelen concentrarse mediante ultracentrifugación; sin embargo, este proceso lleva varias horas y puede producir aerosoles infecciosos para los investigadores biomédicos humanos. Como alternativa, las partículas virales pueden sedimentarse de manera más segura en las células mediante la formación de complejos con sulfato de condroitina y polibreno (CS/PB). Esta técnica aumenta el título viral funcional hasta 3 veces en células que expresan de forma estable el receptor de retrovirus murino, con un tiempo y un coste añadidos insignificantes. La transducción de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se mejora al máximo utilizando concentraciones de CS/PB aproximadamente 4 veces más bajas que el valor óptimo informado previamente para líneas celulares cancerosas, lo que sugiere que la concentración de polímero debe titularse según el tipo de célula diana de interés. Por lo tanto, describimos el uso de bromuro de metiltiazolildifeniltetrazolio (MTT) para analizar la toxicidad del polímero en un nuevo tipo de célula. Observamos una viabilidad equivalente de los HDF después de la transducción viral utilizando la complejación con polímeros o la dosis estándar de polibreno (PB, 6 µg/ml), lo que indica una toxicidad aguda mínima. En este protocolo, describimos el uso de lentivirus ecotrópicos para la sobreexpresión de oncogenes en células humanas, reduciendo los riesgos de bioseguridad y aumentando la tasa de transducción. También demostramos el uso de la complejación de polímeros para mejorar la transducción y al mismo tiempo evitar la centrifugación de partículas virales en forma de aerosol.