Variaciones técnicas en metodologías de secuenciación de ARN de bajo insumo.

Los avances recientes en las metodologías de secuenciación de ARN a partir de cantidades limitantes de ARNm han facilitado la caracterización de tipos de células raras en varios sistemas biológicos. Sin embargo, hasta ahora las variaciones técnicas de estos métodos no se han caracterizado adecuadamente, en cuanto a sensibilidad, empezando por niveles reducidos de ARNm. Aquí, generamos bibliotecas de secuenciación a partir de cantidades limitadas de ARNm utilizando tres métodos basados ​​en amplificación, a saber. Smart-seq, DP-seq y CEL-seq, y demostró variaciones técnicas significativas en estas bibliotecas. La reducción de los niveles de ARNm condujo a una amplificación ineficiente de la mayoría de las transcripciones expresadas de baja a moderada. Además, el ruido en la hibridación del cebador y/o la incorporación de enzimas se magnificó durante la etapa de amplificación, lo que dio como resultado distorsiones significativas en los cambios de las transcripciones. En consecuencia, la mayoría de las transcripciones identificadas expresadas diferencialmente tenían una expresión alta y/o exhibían cambios elevados. En última instancia, las grandes variaciones técnicas enmascararon diferencias biológicas sutiles que obligaron al desarrollo de estrategias mejoradas basadas en la amplificación para la transcriptómica cuantitativa a partir de cantidades limitadas de ARNm.