Base estereoquímica para la pirrolisil-tRNA sintetasa diseñada y la incorporación in vivo eficiente de aminoácidos no nativos estructuralmente divergentes.
Año de publicación:
2011
Identificación de PubMed:
21545173
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
Los aminoácidos no naturales (Uaas) se pueden incorporar traduccionalmente a proteínas in vivo utilizando pares de tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa diseñados, lo que proporciona químicas inaccesibles cuando se restringen a los 20 aminoácidos naturales. Hasta la fecha, la mayoría de las sintetasas evolucionadas cargan Uaas químicamente de manera similar al sustrato nativo de la sintetasa de tipo salvaje; Estos cambios conservadores limitan el alcance de las aplicaciones Uaa. Aquí, adaptamos una sintetasa específica para un aminoácido de cadena larga para cargar una Uaa de cadena corta notablemente dispar. Además, resolvimos la estructura cristalina de la sintetasa diseñada para revelar el mecanismo molecular de un cambio de sustrato tan espectacular. Este análisis multifacético proporciona un nuevo punto de partida para diseñar sintetasas para cargar una selección de Uaas significativamente más diversa de lo previsto anteriormente.
Resumen científico:
Los aminoácidos no naturales (Uaas) pueden incorporarse traduccionalmente a proteínas in vivo utilizando pares de tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa (RS) evolucionados, lo que proporciona químicas inaccesibles cuando se restringen a los 20 aminoácidos naturales. Hasta la fecha, la mayoría de los RS evolucionados aminoacilan Uaas químicamente similar al sustrato nativo del RS de tipo salvaje; Estos cambios conservadores limitan el alcance de las aplicaciones Uaa. Aquí, adaptamos Methanosarcina mazei PylRS para cargar una Uaa notablemente dispar, O-metil-l-tirosina (Ome). Además, la estructura cristalina de rayos X de 1.75 A del PylRS evolucionado formando complejos con Ome y un análogo de ATP no hidrolizable revela los determinantes estereoquímicos para la selección de sustrato. Las mutaciones catalíticamente sinérgicas del sitio activo remodelan la cavidad de unión al sustrato, proporcionando un sitio activo acortado pero más ancho. En particular, la mutación de Asn346, un residuo crítico para la selección específica y el recambio del núcleo químico Pyl, se adapta a diferentes cadenas laterales, mientras que el papel central de Asn346 en la aminoacilación se rescata mediante enlaces de hidrógeno compensatorios proporcionados por A302T. Este análisis multifacético proporciona un nuevo punto de partida para diseñar PylRS para aminoacilar una selección significativamente más diversa de Uaas de lo previsto anteriormente.