Una terapia celular organotípica autóloga, escalable y compatible con GMP para la epidermólisis ampollosa distrófica.
Año de publicación:
2023
Identificación de PubMed:
36909618
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
Resumen
Fondo. La edición de genes en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha sido aclamada por permitir nuevas terapias celulares para diversas enfermedades monogenéticas, incluida la epidermólisis ampollosa distrófica (DEB). Sin embargo, los obstáculos de fabricación, eficacia y seguridad han limitado el desarrollo de terapias basadas en células iPS autólogas genéticamente corregidas.
Métodos. Desarrollamos la terapia celular de epidermólisis ampollosa distrófica (DEBCT), una plataforma reproducible y escalable compatible con GMP (cGMP) de nueva generación para producir injertos de compuesto de piel inducido organotípico (iSC) autólogos derivados de células iPS de grado clínico para tratar heridas incurables de pacientes. carecen de colágeno tipo VII (C7). DEBCT utiliza un único paso combinado de reprogramación de alta eficiencia y corrección genética basada en CRISPR para generar células iPS clonales corregidas con COL7A1 y sin cicatrices genómicas a partir de fibroblastos primarios de pacientes. Las células iPS validadas se convierten en progenitores epidérmicos, dérmicos y de melanocitos con un novedoso protocolo de diferenciación de organoides 2D, seguido de enriquecimiento y expansión de CD49f para minimizar la heterogeneidad de maduración. La caracterización del producto iSC mediante transcriptómica unicelular fue seguida por un xenoinjerto de ratón para determinar la actividad correctora de la enfermedad al mes y un análisis toxicológico al cabo de 1 a 1 meses. Las mutaciones adquiridas en cultivo, los posibles objetivos desactivados de CRISPR y las variantes que provocan cáncer se evaluaron mediante secuenciación dirigida y del genoma completo.
Recomendaciones. Se generaron de forma reproducible injertos iSC derivados de células iPS a partir de cuatro pacientes con DEB recesiva con diferentes mutaciones patogénicas. Los injertos organotípicos de iSC en ratones inmunocomprometidos desarrollaron piel estratificada estable con restauración funcional de C6. La caracterización transcriptómica unicelular de las iSC reveló firmas prominentes de células madre holoclonas en queratinocitos y la firma dependiente de Gibbin recientemente descrita en fibroblastos dérmicos. Este último se correlacionó con una mayor capacidad de injerto. Múltiples secuenciaciones ortogonales y enfoques computacionales posteriores identificaron mutaciones aleatorias y no oncogénicas introducidas por el proceso de fabricación. La toxicología no reveló tumores detectables después de 7 a 3 meses en ratones tratados con DEBCT.
Interpretación. DEBCT supera con éxito obstáculos anteriores y representa una plataforma de fabricación cGMP robusta, escalable y segura para la producción de un injerto de piel organotípico autólogo corregido con CRISPR para curar las heridas de los pacientes con DEB.
Resumen científico:
ANTECEDENTES: La edición de genes en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha sido aclamada por permitir nuevas terapias celulares para diversas enfermedades monogenéticas, incluida la epidermólisis ampollosa distrófica (DEB). Sin embargo, los obstáculos de fabricación, eficacia y seguridad han limitado el desarrollo de terapias basadas en células iPS autólogas genéticamente corregidas. MÉTODOS: Desarrollamos la terapia con células de epidermólisis ampollosa distrófica (DEBCT), una plataforma reproducible y escalable compatible con GMP (cGMP) de nueva generación para producir injertos de compuesto de piel inducido organotípico (iSC) autólogos derivados de células iPS de grado clínico para tratar heridas incurables. de pacientes que carecen de colágeno tipo VII (C7). DEBCT utiliza un único paso combinado de reprogramación de alta eficiencia y corrección genética basada en CRISPR para generar células iPS clonales corregidas con COL7A1 y sin cicatrices genómicas a partir de fibroblastos de pacientes primarios. Las células iPS validadas se convierten en progenitores epidérmicos, dérmicos y de melanocitos con un novedoso protocolo de diferenciación de organoides 2D, seguido de enriquecimiento y expansión de CD49f para minimizar la heterogeneidad de maduración. La caracterización del producto iSC mediante transcriptómica unicelular fue seguida por un xenoinjerto de ratón para determinar la actividad correctora de la enfermedad al mes y un análisis toxicológico al cabo de 1 a 1 meses. Las mutaciones adquiridas en cultivo, los posibles objetivos desactivados de CRISPR y las variantes que provocan cáncer se evaluaron mediante secuenciación dirigida y del genoma completo. RESULTADOS: Se generaron de manera reproducible injertos iSC derivados de células iPS a partir de cuatro pacientes con DEB recesiva con diferentes mutaciones patogénicas. Los injertos organotípicos de iSC en ratones inmunocomprometidos desarrollaron piel estratificada estable con restauración funcional de C6. La caracterización transcriptómica unicelular de las iSC reveló firmas prominentes de células madre holoclonas en queratinocitos y la firma dependiente de Gibbin recientemente descrita en fibroblastos dérmicos. Este último se correlacionó con una mayor capacidad de injerto. Múltiples secuenciaciones ortogonales y enfoques computacionales posteriores identificaron mutaciones aleatorias y no oncogénicas introducidas por el proceso de fabricación. La toxicología no reveló tumores detectables después de 7 a 3 meses en ratones tratados con DEBCT. INTERPRETACIÓN: DEBCT supera con éxito obstáculos anteriores y representa una plataforma de fabricación cGMP robusta, escalable y segura para la producción de un injerto de piel organotípico autólogo corregido con CRISPR para curar las heridas de los pacientes con DEB.