Papel de las enzimas reparadoras de desajustes en la expansión de repetición del triplete GAA-TTC en células madre pluripotentes inducidas por ataxia de Friedreich (iPSC).
Año de publicación:
2012
Identificación de PubMed:
22798143
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
Más de veinte enfermedades genéticas humanas son causadas por la expansión de secuencias repetidas de trinucleótidos simples dentro de genes esenciales, lo que da como resultado proteínas tóxicas (como en las enfermedades por expansión de poliglutamina, como la enfermedad de Huntington (EH)), ARN tóxicos (como en la distrofia miotónica tipo 1), o represión genética (como en la ataxia de Friedreich (FRDA) y el síndrome de X frágil (FXS)). Nuestro laboratorio ha generado células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes con ataxia de Friedreich (FRDA). Al comparar las células antes y después de la reprogramación, encontramos que las repeticiones tripletes se expandieron en las iPSC FRDA. Durante el crecimiento de las iPSC en cultivo, las repeticiones continúan expandiéndose, lo que sugiere que la expansión podría estar relacionada con la replicación del ADN en estas células. La expansión que observamos en las iPSC no ocurre en los fibroblastos (células de la piel) de los que se derivaron las iPSC. De manera similar, al diferenciarse las iPSC de FRDA en neuronas (células cerebrales), se detiene la expansión repetida. Esta observación sugiere que algunos factores celulares necesarios para la expansión pueden expresarse selectivamente en las iPSC, pero no en los fibroblastos o las neuronas. Nuestros estudios han tenido como objetivo comprender las bases moleculares subyacentes a la expansión/inestabilidad de las repeticiones tripletes que hemos observado durante el establecimiento y propagación de iPSC a partir de fibroblastos específicos de enfermedades. Estudios anteriores han implicado a las enzimas reparadoras de errores de coincidencia (MMR) en la expansión repetida en modelos de ratón para otras enfermedades de repetición triplete. Encontramos que el silenciamiento del gen MSH2, que codifica una de las subunidades de las enzimas MMR, impide la expansión repetida en las iPSC FRDA humanas. Descubrimos que los componentes del sistema humano de reparación de errores de coincidencia (MMR) están asociados con los alelos de la enfermedad en las iPSC FRDA, y que el silenciamiento de estos genes a nivel de sus ARN mensajeros es suficiente para suprimir la expansión repetida. Además, hemos monitoreado los niveles de las enzimas MMR en fibroblastos, iPSC y neuronas y, como era de esperar, estas enzimas están presentes en mayores cantidades en las iPSC. Este aumento en la abundancia de estas enzimas celulares podría ser la explicación de la expansión repetida en las iPSC.
Resumen científico:
La mutación genética en la Ataxia de Friedreich (FRDA) es una hiperexpansión de la secuencia de repetición triplete GAA-TTC dentro del primer intrón del gen FXN. Aunque se han informado modelos de levadura y constructos informadores para la expansión de repeticiones del triplete GAA-TTC, los estudios sobre la patogénesis de FRDA y el desarrollo terapéutico están limitados por la disponibilidad de un modelo celular apropiado en el cual estudiar el mecanismo de inestabilidad de las repeticiones del triplete GAA-TTC. en el genoma humano. En este documento, se generaron células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos de pacientes con FRDA después de la transducción con los cuatro factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Estas células se diferenciaron en neuroesferas y precursores neuronales in vitro, proporcionando un modelo celular valioso para FRDA. Durante la propagación de las iPSC, las repeticiones del triplete GAA-TTC se expanden a una velocidad de aproximadamente dos repeticiones del triplete GAA-TTC por replicación. Sin embargo, las repeticiones del triplete GAA-TTC son estables en fibroblastos FRDA y células madre neuronales. Las enzimas reparadoras de desajustes MSH2, MSH3 y MSH6, implicadas en la inestabilidad repetida en otras enfermedades de triple repetición, se expresan altamente en células madre pluripotentes en comparación con los fibroblastos y las células madre neuronales, y ocupan el intrón 1 de FXN. Además, el silenciamiento por shRNA de MSH2 y MSH6 impidió la expansión de repetición del triplete GAA-TTC. Una poliamida pirrol-imidazol específica dirigida al ADN de repetición triplete GAA-TTC bloquea parcialmente la expansión repetida al desplazar MSH2 del intrón 1 de FXN en iPSC FRDA. Estos estudios sugieren que en FRDA, la inestabilidad de repetición del triplete GAA-TTC ocurre en células embrionarias e involucra el sistema de reparación de desajustes altamente activo.