Transcriptómica cuantitativa mediante amplificación basada en cebadores diseñados.
Año de publicación:
2013
Identificación de PubMed:
23624976
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
Se desarrolló un nuevo método para amplificar cantidades límite de ARNm para la secuenciación, lo que permite que la tecnología de secuenciación sea cuantitativa para niveles muy bajos de material de partida. El método se evaluó en un modelo de células madre pluripotentes y reveló que muchos genes que antes no se caracterizaban como mesodérmicos y endodérmicos se expresan a medida que emergen estos tipos de células.
Resumen científico:
Desarrollamos una nueva estrategia de secuenciación de ARN basada en cebadores diseñados (DP-seq) que utiliza un conjunto definido de cebadores de heptámeros para amplificar la mayoría de las transcripciones expresadas a partir de cantidades limitadas de ARNm, preservando al mismo tiempo su abundancia relativa. Nuestra estrategia produjo de manera reproducible altos niveles de amplificación desde tan solo 50 picogramos de ARNm y, al mismo tiempo, ofreció un rango dinámico de más de cinco órdenes de magnitud en concentraciones de ARN. También demostramos el potencial de DP-seq para suprimir selectivamente la amplificación de las transcripciones ribosómicas de alta expresión en más del 70% en nuestra biblioteca de secuenciación. Utilizando la segregación de linaje en cultivos de células madre embrionarias como modelo de embriogénesis temprana en mamíferos, DP-seq reveló nuevos conjuntos de transcripciones poco abundantes, algunas correspondientes a la identidad de la progenie celular antes de que surjan, lo que refleja la especificación del destino celular antes de la capa germinal real. segregación.