El mosaicismo disminuye el valor de las biopsias de embriones previas a la implantación para detectar mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en ovejas.
Año de publicación:
2018
Identificación de PubMed:
30284144
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
La generación de un páncreas humano en ovejas para el trasplante de órganos tendría implicaciones importantes para la actual escasez de órganos de donantes. Para que se desarrolle un páncreas humano en la oveja huésped, se debe bloquear el desarrollo del páncreas del huésped. Aunque la mutación genética de PDX1 puede alterar el desarrollo pancreático, la mutación de este gen en embriones de ovejas ha resultado ineficaz hasta ahora. Aquí, probamos métodos de biopsia embrionaria para el análisis de mutaciones genéticas y descubrimos que el mosaicismo genético puede ser un problema importante para la edición del genoma de embriones de oveja.
Resumen científico:
La producción de modelos ganaderos knock-out (KO) es costosa y requiere mucho tiempo debido a su largo intervalo gestacional y al bajo número de crías. Una alternativa para aumentar la eficiencia es realizar un cribado genético para seleccionar embriones preimplantacionales que hayan incorporado la mutación deseada. Aquí informamos el uso de biopsias de embriones de oveja para detectar mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 dirigidas al gen PDX1 antes de la transferencia de embriones. PDX1 es un gen crítico para el desarrollo del páncreas y el gen diana necesario para la creación de ovejas con discapacidad de pancreatogénesis. Evaluamos la viabilidad de embriones biopsiados in vitro e in vivo, y determinamos la eficiencia de la mutación mediante PCR combinada con electroforesis en gel y PCR digital en gotas (ddPCR). A continuación, determinamos la presencia de mosaicismo en ~ 50% de los fetos recuperados empleando una metodología de secuenciación clonal. Si bien el uso de biopsias no comprometió la viabilidad embrionaria, la presencia de mosaicismo disminuyó el valor diagnóstico de la técnica. Si se pudiera superar el mosaicismo, las biopsias de embriones previas a la implantación para la detección de mutaciones representan un enfoque poderoso que agilizará la creación de animales KO.